研究課題
本研究では、出芽酵母を中心にミトコンドリアの交通システムと品質管理システムについて、クライオ電子顕微鏡（EM）よる構造解析と構造に基づく生化学的・細胞生物学的解析を一気に進め、タンパク質の交通と品質管理に関する新たな原理を確立することをめざしている。今回は，ミトコンドリアの交通システムを構成する外膜のTOM複合体（ミトコンドリアへのタンパク質の搬入口として働く）とSAM複合体（外膜のβバレル型膜タンパク質の構造形成と外膜への組込みを担う）について，以下の結果を得た。（1）TOM複合体は3分子のTom40を3分子のTom22が糊付けする形の3量体と、2分子のTom40から成りTom22を欠く2量体が動的平衡にあり，各々通過させる前駆体基質が異なる。この動的平衡は、外膜の小分子チャネルのポリンによって制御されると，われわれは考えている。今回、チャネル活性を保持するが2量体安定化機能に欠損のあるポリン変異体を取得，この変異体はミトコンドリアの呼吸活性には影響を与えない一方、TOM複合体の動的平衡には影響を与え、2量体の基質のミトコンドリアへの取り込みが阻害された。以上の結果からTOM複合体の基質特異性が3量体-2量体の動的平衡により制御されるというモデルが正しいことが証明された。（2）ミトコンドリア外膜で働くSAM複合体の反応サイクルの様々な分子種について，クライオEM構造を決定し、生化学的解析と組み合わせることで，反応機構を明らかにすることに成功した。特に，基質のβバレル構造形成の機構が、細菌においてβバレル型膜タンパク質の構造形成と膜への組込みを担うBAM複合体の機構とは大きく異なることを明らかにした。
1: 当初の計画以上に進展している
（1）すべてのミトコンドリアタンパク質の搬入口として機能するTOM複合体については，Tom22を含む2量体のクライオ電顕（EM）構造を決定済みであるが，まだ決定できていないミトコンドリア上で主要な分子種の3量体については，安定に電顕測定用のグリッドを作製することが困難であった。そこでノンストップ（NS）ミトコンドリアタンパク質（ストップコドンを除くことによりリボソーム新生鎖（RNC）複合体を形成する）を細胞内で過剰発現することでRNC複合体と作動状態のTOM複合体との複合体を生成し、TOM-RNC複合体として精製、クライオEM解析に供することを検討する。（2）SAM複合体の動的構造変換と作動機構については、すでにSAM複合体-Tom40の構造形成中間体の構造決定に成功しているので、これ以外の構造形成中間体、他の基質についての構造形成中間体の大量調製、構造解析をめざす。（3）2量体-3量体変換の機能的役割については、2量体の基質である膜間部タンパク質のミトコンドリアへの取り込み量が呼吸条件下で増加することから、2量体が担うミトコンドリアタンパク質取り込みの活性を制御する因子の検索を行う。膜間部タンパク質であるTim9にSBPタグを付加した融合タンパク質の発現系を構築したので、発酵・呼吸条件で培養した酵母からストレプトアビジンビーズを用いて基質を精製し、結合因子を解析する。（4）野生型および変異体ポリンのオリゴマー構造をクライオEMで決定する。決定された構造に基づいて、オリゴマー形成やTom22との相互作用に関わる残基の変異体を作成することで，これまで不明であったオリゴマー構造と機能の関係を明らかにする。
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