研究課題
本研究では、出芽酵母を中心にミトコンドリアの交通システムと品質管理システムについて、クライオ電子顕微鏡（EM）よる構造解析と構造に基づく生化学的・細胞生物学的解析を並行して進め、タンパク質の交通と品質管理に関する新たな原理を確立することをめざしている。今回は，ミトコンドリアの交通システムを構成する外膜のTOM複合体（ミトコンドリアへのタンパク質の搬入口として働く）とSAM複合体（外膜のβバレル型膜タンパク質の構造形成と外膜への組込みを担う）について，以下の結果を得た。（1）TOM複合体は3分子のTom40を3分子のTom22が糊付けする形の3量体と、2分子のTom40から成りTom22を欠く2量体が動的平衡にあり，各々通過させる前駆体基質が異なり，後者はMIA経路の基質を主として通過させる。今回MIA経路のインポート効率が呼吸培地と発酵培地で大きく異なることがわかり，その原因となる膜間部および内膜に存在する因子候補を複数同定した。これらの因子は哺乳動物にも保存されており，酵母だけでなく哺乳動物ミトコンドリアにも共通するMIA経路のインポート効率の調節機構の存在が考えられる。（2）SAM複合体については，SAM複合体上でTom40のような基質がどのようにβバレル構造を効率よく，かつ正確に作るのかを明らかにするために，酵母SAM複合体と基質Tom40のフォールディング中間体との複合体のクライオEM構造を決定した。並行して，in vivoジスルフィド結合形成を指標としてTom40のβバレル構造形成過程を構造形成の途中と完成した状態について明らかにした。これらの解析に基づいてSAM複合体よる基質のβバレル構造形成のメカニズムの詳細を解明し，論文発表した。
2: おおむね順調に進展している
（1）ミトコンドリア外膜でミトコンドリアへのタンパク質の搬入口として働くTOM複合体は， TOM複合体は3分子のTom40を3分子のTom22が糊付けする形の3量体と、2分子のTom40から成りTom22を欠く2量体が動的平衡にあるが，これまでのクライオEMによる構造解析では3量体の「コア2量体」部分の構造のみが得られている。3量体の構造決定を目指し，3量体を安定化する方法を検討している。ノンストップミトコンドリアタンパク質を過剰発現してリボソーム-新生鎖-TOM複合体，そして可能であればTIM23複合体から成る超複合体を取得する方法，3量体構造をジスルフィド結合で安定化できるTom40とTom22のCys変異体を作成する方法などを検討した。さらに，2量体の主要経路であるMIA経路の活性が酵母を培養する培地に依存して大きく変わることを見出し，その原因となる因子候補を見出した。（2）SAM複合体については，すでに基質のTom40がβバレル構造を形成するための反応サイクルのSAMの構成サブユニットが異なる2つの状態の構造を決定しているので，今回はβバレル構造を形成途上のSAM -中間体をSAMへの変異導入で安定化し，クライオEM構造を決定した。in vivoジスルフィド結合形成を指標として野生型SAM複合体上でもクライオEM構造と同様の中間体構造が形成されていることを確認し，決定した構造が変異導入によるアーテファクトでないことを証明した。（3）ミトコンドリアを拡大する因子と経路については，ミトコンドリア量が増大するダイオキシックシフト時に発現量が増加するタンパク質Spg1の機能解析を進めている。さらにダイオキシックシフト時に拡大する核-液胞間コンタクト（NVJ）について，拡大に関与する新規因子も同定した。
（1）すべてのミトコンドリアタンパク質の搬入口として機能するTOM複合体については，Tom22を含む2量体のクライオ電顕（EM）構造を決定済みであるが，三量体の構造はまだ決定できていない。三量体の存在は架橋実験の結果だけでなく原子間力顕微鏡の観察結果からも明かであるものの，三量体は不安定で，グリッド作成時には二量体に変換されてしまうことが問題であった。三量体のみを安定化する手法を検討中であるので，この実験系をスケールアップし，三量体を大量調製してクライオEMによる構造解析を目指す。（2）SAM複合体の動的構造変換と作動機構については，すでにSAM複合体-Tom40の構造形成中間体の構造決定に成功しているが，今回共同研究グループによって新規サブユニットが発見されたので，このサブユニットを過剰発現してこのサブユニットを含むSAM複合体を大量調製し，構造解析をめざす。（3）TOM二量体-三量体変換の機能的役割 については，二量体の基質である膜間部タンパク質のミトコンドリアへの取り込み量が呼吸条件下で増加することから，二量体が担うミトコンドリアタンパク質取り込みの活性を制御する因子の検索を行った。その結果いくつかの候補を得たので，それらの因子が膜間部へのタンパク質輸送経路，膜間部での酸化的フォールディングにおいてどのような働きをするのか，解析を進める。(4)出芽酵母のミトコンドリアを拡大する因子と経路については，ミトコンドリアが劇的に拡大するグルコース飢餓条件下で，核-液胞間のコンタクトサイトに特異的に集積するタンパク質の同定に成功したので，その因子の機能解析からミトコンドリア量の調節機構の詳細を明らかにする。
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すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (6件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 4件、 招待講演 5件) 備考 (1件)
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