造血幹細胞体外増幅系を用いた幹細胞性・加齢・発癌機構の解析

2023 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20H05695
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 中内 啓光 東京医科歯科大学, 高等研究院, 特別栄誉教授 (40175485)
• 研究分担者: 水野 直彬 東京医科歯科大学, 高等研究院, プロジェクト研究員 (30815642) ; 岩間 厚志 東京大学, 医科学研究所, 教授 (70244126)
• 研究期間 (年度): 2020-08-31 – 2025-03-31
• キーワード: 造血幹細胞 / ex vivo増幅 / クローナル造血 / CRISPRgRNAスクリーニング

研究実績の概要

これまでの研究成果として、長期培養後のマウス造血幹細胞の骨髄再構築能と相関する細胞表面マーカーを同定した。また、本培養法において5% O2の低酸素条件下では機能的な造血幹細胞分画がさらに高度に濃縮されることがわかったが、酸素濃度を1%まで低下させた条件で培養した造血幹細胞の骨髄再構築能は、5% O2条件下で培養した群と比較して低いことが判明した。これらのことから、造血幹細胞の長期培養増幅に最適な酸素濃度は5%であることを確認した。現在は本培養で用いる培地の特性を評価するため、長期培養後に認める造血幹細胞分画以外の細胞集団についてその表現型や生体内での機能解析を行っている。また、マウス造血幹細胞の長期培養と遺伝子変異の集積を経時的に評価し、長期の造血幹細胞の培養が遺伝子変異の蓄積と相関することをwhole exon sequencingを用いて明らかにした。
ヒト造血幹細胞の増幅培養に関しては、caprolactam-based polymer、740Y-P (a PI3K activator)、butyzamide (THPO receptor agonists)を組み合わせる事で無血清増幅培養を達成した（Sakurai, Yamazaki, Nakauchi et al., Nature, 2023）。この手法では、マウスPVA培地による培養と異なり、サイトカインSCF/TPOをpeptide／化合物へ置換する事で、安定して2週間、最長で一か月の体外培養増幅を可能とした。
現在は臍帯血ロット間で造血幹・前駆細胞分画の増幅率に影響を与える因子の解析を行いつつ、マウス造血幹細胞培養で重要な因子であった酸素濃度の影響を調べている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究において最重要の課題であったヒト造血幹細胞培養に関しては、従来の血清培養から合成ポリマーとpeptide、化合物によるchemically defined mediumによる培養法を確立し、既報の培養法と同等以上の期間、増幅培養を続ける事に成功した。
当該培養法では、使用する臍帯血のロットによる培養効率差が激しいという問題があるが、これまでの研究成果から候補となる要因を抽出済みであり、検証を進めている。
また、本培養法をベースに、造血器悪性腫瘍や造血系加齢性変化をin vitroで再現する研究も進行中である。既にいくつかの遺伝子破壊により表現型変化を確認できている。

今後の研究の推進方策

最終年度である本年度は、既報とこれまでのスクリーニング結果から候補として挙げられた遺伝子群のゲノム編集により、実際の造血幹細胞性に影響が出るか、また加齢性変化を十分に再現できているか、マウスへの移植によりin vivoで確認する。
また、PVA培地によるマウス造血幹細胞体外培養増幅と比較して、2023年に発表したヒト造血幹前駆細胞培養に用いる合成ポリマーをベースとしたchemically defined mediumでは極端に試行群による差があった。この要因としては臍帯血ロット差の影響が最も大きいと考えられ、表面マーカーによる特異分画の多少による品質判定や低酸素培養等による活性酸素の影響低減などの評価を通じて、体外増幅培養期間の延長と安定化、増幅効率上昇を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Chemically defined cytokine-free expansion of human haematopoietic stem cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Sakurai Masatoshi,Ishitsuka Kantaro,Ito Ryoji,Wilkinson Adam C.,Kimura Takaharu,Mizutani Eiji,Nishikii Hidekazu,Sudo Kazuhiro,Becker Hans Jiro,Takemoto Hiroshi,Sano Tsubasa,Kataoka Keisuke,Takahashi Satoshi,Nakamura Yukio,Kent David G.,Iwama Atsushi,Chiba Shigeru,Okamoto Shinichiro,Nakauchi Hiromitsu,Yamazaki Satoshi
  • 雑誌名: Nature 巻: 615 ページ: 127～133
  • DOI: 10.1038/s41586-023-05739-9
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Physioxia improves the selectivity of hematopoietic stem cell expansion cultures (2023)
  • 著者名/発表者名: Igarashi Kyomi J.、Kucinski Iwo、Chan Yan Yi、Tan Tze-Kai、Khoo Hwei Minn、Kealy David、Bhadury Joydeep、Hsu Ian、Ho Pui Yan、Niizuma Kouta、Hickey John W.、Nolan Garry P.、Bridge Katherine S.、Czechowicz Agnieszka、Gottgens Berthold、Nakauchi Hiromitsu、Wilkinson Adam C.
  • 雑誌名: Blood Advances 巻: 7 ページ: 3366～3377
  • DOI: 10.1182/bloodadvances.2023009668
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] ポリマーを用いたヒト臍帯血CD34+細胞の長期培養増幅における酸素濃度の影響 (2024)
  • 著者名/発表者名: 岡部 基人、水野 直彬、中内 啓光
  • 学会等名: 第46回 日本造血・免疫細胞療法学会総会