| 研究課題/領域番号 |
20J00329
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
錦野 達郎 大阪大学, 大阪大学蛋白質研究所, 特別研究員(PD) (80884428)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
|
| キーワード | 細菌べん毛モーター / 固定子 / エネルギー変換 / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / 溶液NMR / イオンチャネル |
|---|
| 研究実績の概要 |
細菌の運動器官の一つであるべん毛は、回転するモーターをもつ超分子複合体である。モーターは自身が回転する「回転子」と回転子の周りに集合しイオンチャネルとして機能する「固定子」の2種類の複合体から成る。モーターの回転は、固定子への共役イオンの流入とカップルした回転子と固定子の相互作用により、膜内外に形成される電気化学ポテンシャル差が運動エネルギーに変換されることで生じる。固定子は、5分子のAサブユニット(PomA)と2分子の Bサブユニット(PomB) からなる膜貫通タンパク質複合体である。その構造はクライオ条件下での単粒子解析により明らかになっているが、エネルギー変換の際の複合体の構造変化や共役イオンの通り道は未だによくわかっていない。本研究では、これらを明らかにするためにNa+チャネルである海洋性ビブリオ菌の固定子複合体[PomA/PomB]の構造情報をクライオ条件での単粒子解析と溶液核磁気共鳴法(NMR)により取得することを目的としている。
昨年度(研究初年度)は、クライオ条件での単粒子解析法の取得のために高度好熱菌Aquifex aeolicusの固定子Aサブユニット(MotA)複合体の解析とNMR解析技術の習得のために固定子の相互作用相手であり回転子を構成するタンパク質の一つであるFliGの解析を進めた。現在、これら２つの研究成果を論文にまとめ投稿する準備を進めている。
今年度は、クライオ条件でのPomAPomB複合体の単粒子解析を進めた。複合体の密度マップを得ることができたため、モデル構築と精密化の作業を進めている。溶液NMRでの解析では、複合体中のメチオニン残基側鎖のメチル基を13C標識した測定試料を調製し、NMR測定を行った。野生型とNa+イオン透過が阻害されるD24N変異体のスペクトルを取得し比較したところ、スペクトルの変化が見られた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度までにクライオ条件でのPomAPomB複合体の単粒子解析では、撮影用の試料を調製しクライオグリッドのスクリーニングを行ったところ、試料の変性や凝集が見られていた。そこで本年度は、試料の変性や凝集が抑えられる条件の検討を行った。その結果、比較的試料の変性や凝集が抑えられる条件を見つけることができたため、受け入れ研究機関の大型装置の一つであるTitan Kriosクライオ電子顕微鏡で試料の撮影を行った。単粒子解析ソフト Relion 3.1を用いて、得られたデータの単粒子解析を行ったところ、4オングストロームを切る分解能を持つ密度マップを得ることができた。このマップを用いて、PomAPomB複合体のモデル構造の構築と精密化の作業を進めている。
PomAPomB複合体のモデル構造構築のめどが立ったこともあり、PomAPomB複合体の溶液NMR解析にも着手した。溶液NMR法ではタンパク質を安定同位体標識した試料が 0.1 mM程度の濃度で 0.3 ml程度必要である。また、分子量が大きいほどシグナルの数の増加や線幅の広がりが見られ解析が困難になることから、分子量30 kDa程度のタンパク質が解析の限界であった。PomAPomB複合体は、分子量約200 kDaの膜タンパク質複合体であり、その分子量と収量(LB培地 1 Lの培養から試料1 mg/ml程度の収量 (0.005 mM))から、一般的なタンパク質の試料調製法では解析が困難であることが予想されていた。そこで、比較的感度がよく測定試料の濃度が0.01 mM程度でも構造情報の取得が可能なメチオニン残基側鎖のメチル基を13C標識したPomAPomB複合体試料を調製し、NMR測定を行った。野生型とD24N変異体の1H-13C HMQCスペクトルを取得し、比較したところ、スペクトルに変化が見られた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
PomAPomB複合体の単粒子解析では、モデル構造の完成を目指す。得られたモデル構造からイオン透過に重要な残基を推定して変異体を作成することで、変異により生じる構造変化とモーターの回転への影響を調べる。そのうえで、D24N変異体や新たに作成した変異体で機能に変化が見られるものの単粒子解析を進める。
NMR解析では、共役イオンであるNa+の濃度を変化させてメチオニン残基側鎖メチル基のスペクトルを取得することで、Na+の結合や透過によって生じる構造変化を解析する。ケミカルシフト変化が見られるメチオニン残基を特定するためにシグナルの帰属も進める。変異体の作成とその解析が順調に進んだ場合は、特徴的な変異体でもメチオニン残基側鎖メチル基のスペクトルを取得に着手する。
昨年度まで必要な解析がほとんど済んでおり論文化を進めているAqufex aoelicus MotAの単粒子解析と溶液NMRでのFliGの構造解析の内容は論文の投稿を目指す。PomAPomA複合体の単粒子解析と溶液NMR解析の内容も論文化を進める。
|
