| 研究課題/領域番号 |
20J00947
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
石黒 健介 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員(PD)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
|
| キーワード | RNA修飾 / リボソーム / クライオ電子顕微鏡 / 翻訳制御 / 結晶構造解析 |
|---|
| 研究実績の概要 |
近年、リボソームが環境に応じてダイナミックに組成を変化させ、翻訳や細胞の生育を制御することが示唆されつつある。しかし、その詳細な機構は依然としてほとんど明らかとなっていない。本研究では、申請者が大腸菌で同定した嫌気環境特異的な3つのrRNA修飾による翻訳制御機構の解明を進めた。採択前までの申請者の研究により、これらの修飾は嫌気環境依存的に修飾率が上昇し、リボソームの翻訳能を向上させて細胞の生育に寄与することが示唆されていた。また、前年度の構造学的および生化学的な解析により、3つの修飾がPTCの構造安定化を通じてペプチド転移反応効率を向上させ、嫌気環境での細胞生育に貢献していることを示唆された。
本年度では、メチル化修飾酵素RlmPのin vitro酵素反応実験および構造解析を中心に研究を進めた。その結果、RlmPの最小基質として23S rRNAのHelix 89を中心とする130base程度のRNAを特定した。さらに、isotope標識されたSAMを用いた実験により、RlmPによる修飾反応でSAMがメチル基供与体として働いていることを証明した。一方、2-7mg/ml程度のリコンビナントRlmPを用いた結晶化スクリーニングでは、タンパク質結晶を得ることはできなかった。これは、好気環境下でのスクリーニングではRlmPの活性中心が不安定、不活性となってしまうためと推測される。そこで今後嫌気環境下でのRlmPの結晶化スクリーニングを行う予定である。
その他の実験としてSUNRISE法に用いる株の樹立および実験条件の検討を進めた。また、急激な酸素濃度変化に応答した3つのrRNA修飾の修飾率の変化を解析し、嫌気環境から好気環境への移行において３つの修飾の修飾率が迅速に低下することを明らかにした。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究計画として、1, RlmPの構造及び酵素反応機構の解明、2,in vivoでの細胞内翻訳速度の解析、3,酸素濃度に応答したRNA修飾率の解析を並行して進めた。結果として、1の酵素反応機構の解明についてはRNA最小基質の特定および酵素反応機構の詳細の解明を進め、一定の成果を得ることができた。一方、結晶解析においてはさまざまな条件でのスクリーニングを行なったもののタンパク質結晶を得ることができなかったが、現在嫌気環境下でのスクリーニング作業を継続して進めている。2についてはSUNRISE法に用いる株を構築し、実験条件の検討を進めている。3については修飾率解析はある程度進んだが、翻訳量解析については現時点で手付かずである。全体を通してみると、概ね当初予定通りに実験計画を進行することができていると考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
まず、嫌気環境下におけるRlmPの結晶化スクリーニングを進める。十分な大きさのタンパク質結晶が得られた場合、これを解析する。また、前年度までの解析により得られたRNA最小基質との複合体を形成させ、結晶化スクリーニングを進めることも目指す。結晶化がうまくいかない場合は、Cryo-EMによる解析も検討する。また、前年度からの継続として、SUNRISE法による細胞内翻訳伸長速度の解析を進めるとともに、酸素濃度が急激に変化した際の３つの修飾率の変動及び、細胞内翻訳プロファイルの変化をLC/MSとリボソームプロファイリングを用いて解析する。
|
