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令和3年度は昨年度に引き続き「MTA1-S100A4複合体形成を検出するスクリーニング系の構築」から行なった。
遅延していたFLAGタグを付加したヒトMTA1発現ベクターおよびHAタグを付加したヒトS100A4発現ベクターの作製に関しては、本年度初めに全種類のベクターの作製が完了し、かつその全種類のベクターにおいて目的の融合タンパクが発現することも確認した。また、このベクターを使用して行った共免疫沈降法により、MTA1はN末端側および中央部分を介してS100A4と結合していることを明らかにした。
続いて、Alpha protein-protein interaction (perkin elemer社)を利用したスクリーニング系の構築に進んだが、当初予定していたベクターを導入した細胞の溶解液を使用する系では、目的のタンパク質以外のタンパク質が溶液中に多量に存在する状況になり、このことが大きな障壁となることによってMTA1-S100A4複合体の評価が困難になっていた。そこでHisタグを付加したヒトMTA1発現ベクターおよびGSTタグを付加したヒトS100A4発現ベクターを作製し、精製タンパクを用いて相互作用を評価する系への変更を行った。変更後のベクター作製、大腸菌によるタンパク発現および目的タンパクの精製がそれぞれのステップで問題ないことを確認したのち、再度Alpha protein-protein interactionでのスクリーニング系の構築を行った。最終的に、MTA1-S100A4複合体の形成を発光量で簡便に評価できるスクリーニング系の構築が完了した。
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