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昨年度実施したイヌ腫瘍細胞株由来DAMPs添加時のマクロファージ細胞株の遺伝子発現解析結果をもとに、本年度はNF-κBを活性化する新規DAMPの同定を試みた。そこで、NF-κBレポーター遺伝子を恒常発現するマクロファージ細胞株を作製し、壊死細胞上清を添加したところ、いくつかのイヌ腫瘍細胞株およびマウス腫瘍細胞株でNF-κBの強い活性化が認められた。そこで、このレポーター活性を指標に、マウス腫瘍細胞株由来の壊死細胞上清を限外濾過による濃縮、さらに液体クロマトグラフィーによる精製を繰り返したところ、20-30kDaの分画でNF-κBの活性化が認められた。そこで、質量分析によりこの分画に含まれる分子を探索したところ、新規DAMP候補分子として分子Xを同定した。興味深いことに分子Xは細胞質内で作用する分子であり、細胞外での役割は全く報告されていなかった。そこでCRISPR-Cas9によって作製した分子X欠損腫瘍細胞株から壊死細胞上清を作製したところ、これまで確認できていたNF-κBの活性化が完全に消失することがわかった。以上の結果は、細胞壊死に伴って細胞外に放出された分子Xが免疫細胞のNF-κBを活性化し、炎症反応を強く誘導するDAMPsとして機能する可能性を示唆するものである。今後は分子Xのリコンビナントタンパクの作製および分子Xを恒常的に細胞外に分泌する腫瘍細胞株を作製し、これらを用いて分子Xの詳細な炎症誘導メカニズムの検討および腫瘍微小環境における役割の解明を行っていく予定である。
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