| 研究課題/領域番号 |
20J20649
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
野村 幸汰 大阪大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| キーワード | 糖タンパク質 / 反応開発 / タンパク質化学合成 / 糖鎖 / アミド結合 / 翻訳後修飾 / インターロイキン / サイトカイン |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ウイルス感染や癌細胞転移に関わる重要な創薬ターゲットである糖タンパク質の迅速な合成法の確立を目的とし、最初に有用な素反応の開発を行った。本素反応はアミノチオアシッドとペプチドチオアシッドを化学選択的に縮合させ、アミド結合を与える反応である。各種条件検討の結果、温和な酸化によるジアシルジスルフィド中間体の形成、及び続くアシル基転移反応を利用したジアシルジスルフィドカップリング(DCC)の開発に成功した。さらに既存のライゲーション方法であるチオアシッドキャプチャライゲーション(TCL)をβ位にメルカプト基を導入したバリン誘導体に応用することで、チオアシッドを基盤とした糖タンパク質迅速合成法の開発を達成した。
本合成法を用いることで、免疫細胞の遊走性を誘起するサイトカインの一種、CCモチーフケモカインリガンド1(CCL1)及び、すい臓がん組織において分泌されるセリンプロテアーゼの阻害剤であるセリンプロテアーゼインヒビターカザルタイプ13(SPINK13)のα2,6-シアリル複合型糖鎖グリコシル化体の全合成を達成した。いずれの合成も従来の合成法では10-20工程以上を要し、糖鎖に対する収率は数%～1%未満であるのに対し、本合成法では10～20％の収率を達成した。
続いて、大腸菌発現を用いたペプチド鎖の大量合成を本合成法に利用可能であるか検討した。タンパク質のペプチド鎖部分は大腸菌により合成し、開発した合成法に則して糖鎖をペプチド鎖の任意のポジションへ導入することで、造血細胞増殖活性を有するインターロイキン3(IL3)α2,6-シアリルシアリル複合型糖鎖グリコシル化体の半合成を達成した。タンパク質のフォールディングはCD及びHRMSを用いて確認した。合成した糖鎖結合型のIL3は共同研究先にて造血活性を測定し、現在解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
今年度は当初今年度に予定していた課題(1)、さらに翌年度に予定していた課題(2)を含めた研究を遂行した。
(1)糖タンパク質迅速合成法の確立
検討していた素反応の開発に成功したため、それを応用して糖鎖を任意のペプチド鎖へ挿入する新規糖タンパク質合成法を確立した。さらに本合成法を利用することでサイトカインであるヒト型CCL1、IL3、及びセリンプロテアーゼ阻害剤であるSPINK13の複合型シアリル糖鎖グリコシル化体の迅速合成を行った。
(2)合成したインターロイキンの活性評価
合成したα2,6-シアリル複合型糖鎖を有したIL3を用いて、TF1細胞の増殖活性を評価した。現在解析中であるが、糖鎖を有さないIL3と比較しており、得られた結果から糖鎖の機能の解明を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は本合成法をより広範に用いることのできる合成法とするために、糖鎖を導入する際に用いるTCL反応をシステイン以外のアミノ酸にも応用できないか検討する予定である。方法としては、システインを各種β位メルカプトアミノ酸で置換する予定であり、現在βメルカプトバリンにおいては達成している。
さらに、現在α2,6-シアリル複合型糖鎖のみをタンパク質へ導入しているが、今後は現在新たに合成したO結合型糖鎖をタンパク質へ導入し、N結合型糖タンパク質以外のサイトカイン類の合成を行う予定である。最終的に自由自在に糖鎖をタンパク質へ導入することで、より高い活性をもつ次世代型バイオ医薬品の創出を行いたいと考えている。
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