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本研究課題は、ゲノム編集を基軸とした巨大酵素の機能解析とエンジニアリングを目的として研究を進めている。昨年度までに、ゲノム編集による麹菌ホットスポットへの遺伝子導入によって、繰り返し型ポリケタイド合成酵素 (HR-PKS)の網羅的解析を行い、立体制御の一般的な規則を提唱した。本年度は、HR-PKSによる骨格形成以降の反応に焦点をあて、酸無水物二量体ホモイドライドB生合成を研究対象として、構造多様性創出に寄与する酵素遺伝子の探索を行った。
ホモイドライドBはコレステロール値低下作用を示す糸状菌由来天然物であり、無水マレイン型モノマーが二量化した構造を有する。糸状菌は同様のモノマーによって合成される酸無水物二量体を多数生産するが、ホモイドライドBは他の類縁体には見られない特徴的なカゴ型構造を有している。本年度は、カゴ型構造形成機構を明らかにし、ポリケタイド系天然物の構造多様性創出の鍵となる酵素の探索を行った。以前に構築していた骨格構造生産麹菌に対して、生合成遺伝子クラスター中の機能未解析遺伝子4種の追加導入を行った結果、最終産物ホモイドライドBを観測することに成功した。次いで、ゲノム編集による迅速な機能解析によって、導入遺伝子の組み合わせを変えた形質転換体を作製することで、メチル基転移酵素がカゴ型構造形成の鍵酵素であることを明らかにした。本酵素の反応機構を詳細に解析する為、大腸菌により組換えタンパク質を調製し、補酵素の有無、阻害剤の添加、メチル化副生成物の構造決定によって、SAM依存的メチル化を起点としたアセタール形成によって、カゴ型構造が構築されることを明らかにした。この機構は初の解析例であることに加え、TstEホモログが類縁PKSクラスターでも観測されたことから、同様のカゴ型構造を有する天然物探索にも展開できると考えられる。
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