研究課題
本研究は、FBXL5を分解制御する因子を同定することを目的とする。予備的実験においてFBXL5の分解を蛍光でモニターできるレポーター細胞を作製した。CRISPR/Cas9システムを用いたゲノムワイドスクリーニングをおこなうために、レンチウイルスを用いてsgRNA (single guide RNA)ライブラリーを蛍光レポーター細胞に導入した。ライブラリー導入細胞の中で鉄欠乏条件下において蛍光が安定化している細胞集団をセルソーターで回収し、次世代シークエンスにより回収後の細胞に濃縮されたsgRNA配列を探索した。しかしながら、今回の解析では統計学的に有意に回収後の細胞に濃縮されたsgRNA配列を同定することが出来なかった。並行して、生化学的手法によるスクリーニングをおこなった。FBXL5の野生型鉄結合ドメインまたはデグロンを欠損した変異型鉄結合ドメインを過剰発現した細胞を用いてIP-MSをおこない、野生型鉄結合ドメインに特異的に結合するユビキチンリガーゼを複数同定した。しかし、これらの候補因子をノックダウンしてもFBXL5の安定化を確認することが出来なかった。次なる方策として、公共データベースを利用したin sillicoスクリーニングを検討している。FBXL5を分解制御する因子は、FBXL5の発現レベルと逆相関する可能性が高い。現在、大規模ながん細胞の遺伝子発現データを再解析することで、FBXL5の上流因子の探索をおこなっている。
3: やや遅れている
並行して進めていた遺伝学的スクリーニングと生化学的スクリーニングの両方で期待通りの結果を得ることが出来ず、当初の計画からは遅れが生じている。
大規模がん細胞データベースを利用したin sillicoスクリーニングをおこない、候補因子が見つかり次第、検証実験を進めていく。
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Nucleic Acids Research
巻: 49 ページ: 7298～7317
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Genes to Cells
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