| 研究課題/領域番号 |
20J21363
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
矢ヶ崎 怜 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| キーワード | 蠕動運動 / オルガノイド / ペースメーカー細胞 / 同調 |
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| 研究実績の概要 |
消化管の蠕動運動は平滑筋、腸管神経、カハール介在細胞(Interstitial cells of Cajal:以下ICCと呼ぶ)によって制御されている。本研究はこの３種類の細胞がどのように同調性を確立するのかを明らかにすることを目的としており、すでにトリ胚消化管の筋肉層の細胞培養法を確立し、蠕動運動を模したオルガノイドを作製することに成功している。採用一年目では、課題となっていたトリでのICC特定のために、マーカーであるc-Kitに対する抗体を作製し、検証を進めてきた。そこで、採用二年目である前年度は、この抗体の有用性の検証を引き続き行うとともに、蠕動運動を模したオルガノイド同士の同調メカニズムに関する研究を行った。抗体の有用性の検証では、c-Kitを発現する複数の組織をin situ ハイブリダイゼーション法と免疫染色法を用いて染色し、発現パターンを比較した。トリ胚の組織は固く、透過性がしばしば問題となったが、透明化処理を組み合わせることで解決した。結果、染色パターンは一致しており、ウェスタンブロットや細胞免染とのデータも踏まえ、今回作製したc-Kit抗体はトリに対して有用であると判断した。
次に蠕動運動を模したオルガノイド同士の同調メカニズムに関する研究について報告する。オルガノイドが主にICCと平滑筋によって構成されていることをすでに明らかにしている。また、オルガノイド同士が結合すること、そして結合後には独立したリズムで収縮を示していた２つのオルガノイドが同調した収縮を示すことが分かっている。この２つのオルガノイドが結合する様子を観察したところ、それぞれのオルガノイドから細胞突起が伸出していることを見出した。そこで、その細胞突起を介してオルガノイド同士の同調が起こるのではないかと考え、解析を開始した(京大ウイルス研・永樂研究室との共同研究)。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度は主に新たに作製した抗体の検証と、オルガノイド間の同調メカニズムに関する解析に取り組んだ。
まず抗体の検証について述べる。新たに作製したニワトリのc-Kitに対する抗体の検証を引き続き行い、完了した。具体的にはc-Kitを発現する複数の組織で免疫染色を行い、in situ hybridization法による発現パターンとの比較を行った。その過程で、浸透性が問題になったが、透明化処理を組み合わせることで解決した。組織の免疫染色に加え、ウェスタンブロットや免疫細胞染色などの結果も踏まえ、ニワトリに対しこの抗体が有用であると結論づけた。この抗体を用いることで長年の課題であったニワトリ細胞でのICCの特定が可能となる。次に、新たに開始したオルガノイド間の同調メカニズムの解析について述べる。最適な条件を特定するため、ゲル底面の基質やゲルの種類、オルガノイドの培養日数などを変更しながら実験を繰り返し行い、現在条件検討はほぼ完了した。
以上のことから、おおむね順調に進んでおり、最終年度はさらに解析をすすめていくことができると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は腸収縮性オルガノイドで見られる、オルガノイド内での同調と複数のオルガノイド間での同調という２つの同調に着目し解析していく。
まず１つ目のオルガノイド内の同調について述べる。前年度までの研究から、このオルガノイドが主に平滑筋とカハール介在細胞(ICC)で構成されていることを明らかにした。ICCは蠕動運動のペースメーカー細胞として知られ、ICCから平滑筋へシグナルが伝達される。一方で、平滑筋からICCへのシグナル伝達はわかっていない。そこで、このオルガノイド内の同調がICCから平滑筋への一方向のシグナル伝達で行われているのか、または相互のシグナル伝達によるものか、Ca2+変化を指標に明らかにする。まずは、阻害剤を用いて腸収縮オルガノイド内の平滑筋を抑制し、その影響を調べる。次に、ICC優位な培養系を確立し、平滑筋が存在しない環境下でのCa2+変化を調べる。同調を示さない場合はICC優位な培養系に平滑筋を加えてその変化を調べる。
次に、複数のオルガノイド間の同調について述べる。前年度から開始した3Dゲルを用いた解析を継続して行う(京大ウイルス研永樂研究室との共同研究)。この解析では、ゼラチンゲルを用いてオルガノイド間の接触を細い通路を介した接触のみに制限している。すでに、この通路内にオルガノイドが突起を伸出すること、オルガノイド間での同調した収縮とCa2+変化を確認している。しかし、ゲルを足場にゲル底面と上面に這い出た細胞も確認されており、突起を介した同調か検証する必要がある。したがって、今年度はまず２つの方法でこの検証を行う。１つ目はオルガノイド間の同調確認後、通路内の突起を切断し同調の変化を調べる。もう１つは通路のないゲルを作製し、その際も同調が起こるかを明らかにする。これらの検証後、同調を担う細胞種の特定と同調するまでの過程を明らかにする。
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