研究課題
申請者は、精巣内でのヒストン修飾酵素遺伝子のノックダウンおよびアップレギュレーションを行い生殖細胞特異的にヒストン修飾の加齢型変異を誘導するために、アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いて精巣内で生殖細胞特異的にターゲット遺伝子の発現を制御する方法を確立することを試みた。作製したAAVを精細管へインジェクションすることによって、精巣内の細胞に感染させることに成功した。しかし、精巣内の体細胞への強い感染は確認されたものの、生殖細胞への感染率は高くなく、感染率を上げる必要があった。そこで、プラスミドに生殖細胞特異的なプロモーターを組み込むことや、同時にペプチドをインジェクションすることにより感染率の向上を試みた。また、AAVのセロタイプについても再度検討した。これらにより、当初よりは感染している生殖細胞が多くみられたが、精原細胞への感染率は未だ改良する必要がある。また、同時に、神経発生に重要であり種々の分子と複合体を作りエピゲノムの変化ももたらす転写抑制因子REST/NRSFについても精巣での局在を確認し、加齢による変化について解析を行った。申請者の所属する研究室では、加齢マウス由来の精子では多くのDNAの低メチル化領域が検出されており、それらの領域がREST/NRSF結合領域を多く含むことも報告している。精巣でのREST/NRSFの加齢による変化が、精子でのDNA低メチル化やその他のエピゲノム因子、子孫の表現型変化にどう影響するのかは非常に興味深い。さらに、REST/NRSFはmiRNAの抑制を介して遺伝子の発現抑制を行うことも報告されており、各エピゲノム因子が相互に関係し合っていることが分かる。今後は、加齢により変化し子孫の表現型に影響するエピゲノムを複合的に理解するために、精巣におけるREST/NRSFの機能やmiRNAの発現変化の解析も行っていく。
2: おおむね順調に進展している
アデノ随伴ウイルス（AAV）による精巣での遺伝子発現制御に関して、感染率が低いという問題があったが、プラスミドに生殖細胞特異的なプロモーターを組み込むことや、同時にペプチドをインジェクションすること、AAVのセロタイプを再度検討することで対応した。これらにより、当初よりは感染している生殖細胞が多くみられたが、精原細胞への感染率は未だ改善の余地がある。また、精巣内でも発現が確認され、エピゲノム変化にも関わるREST/NRSFの発現変化の解析については、加齢により発現時期の変化がみられる可能性を見出しつつある。新規の実験系の導入も必要になったため計画の見直しを行いつつ、複数のエピゲノム因子を検証することで、相互に関係し合う精子エピゲノムの加齢による変化を解明していきたい。
生殖細胞特異的な感染を目指してアデノ随伴ウイルス（AAV）の感染率の改良を行なったが、さらに感染率を上げるために、感染率向上の可能性のある他のペプチドのインジェクションも行う。また、生殖細胞特異的に遺伝子の発現を変化させる他の方法としては、体外で培養しAAVを感染させたGS細胞を移植するなどの方法が考えられる。当初はヒストン修飾に焦点を当てた実験を主軸にしていたが、エピゲノム変化はいくつもの因子が互いに関係し合いながら起こるものであり、今後は父加齢による次世代への影響についてより広く理解するために他の因子の解析も進めたいと考えている。まず、REST/NRSFの加齢による発現の変化については、今後は発現時期の変化について詳細に検証していく。さらに、REST/NRSFの遺伝子発現抑制機能にも関わるmiRNAに関しては、加齢による発現の変化を検出するためにサンプリング時の条件検討を行なっている。外部の研究者にもご指導いただいており、条件検討が終わり次第マイクロアレイなどの発現解析を行う。このように、相互作用しながらお互いを制御するエピゲノム因子を複合的に解析することで、父親の加齢による次世代の表現型変化の原因解明を進めていく。
すべて 2022 2021
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 1件)
Developmental Dynamics
巻: 251 ページ: 525-535
10.1002/dvdy.417
EMBO reports
巻: 22 ページ: e53539
10.15252/embr.202153539
