| 研究課題/領域番号 |
20J22603
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
山内 悠至 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| キーワード | 機能的セルオミックス法 / 高次生命現象 / 神経ネットワーク / オプトジェネティクス / シングルセル解析 / Cre-loxP / 線虫（C. elegans） |
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| 研究実績の概要 |
【研究背景】
記憶や学習といった生物の複雑な生命現象は、その生物が持つ神経ネットワークが適切に働くことで創発する。しかし、どの神経ネットワークが働くと、どの高次生命現象が引き起こされるのかについてはほとんどが未解明なままであった。その原因の一つは、神経ネットワークレベルで、各ニューロンの機能を網羅的に調べられる方法論が存在していないためである。そこで、シングルセルレベルで各ニューロンの機能を網羅的に調べられる新規方法論「機能的セルオミックス法」の開発に取り組んできた。
【前年度までの結果】
前年度までに、「機能的セルオミックス法」の核である「光活性型オプシンの発現パターンのランダム化」が実現可能であることを示した。また、「オプシン発現パターンがランダム化した」線虫ライブラリーを用いて、線虫の産卵行動に関わるニューロンの同定に成功してきた。一方で、線虫ニューロンに対するオプシンの発現率は約30％と高く、複雑な神経ネットワークの機能同定が難しいという問題点があった。そこで、オプシン標識率の自由な制御に着手した。
【当該年度の結果】
前年度までの課題であった、線虫ニューロンに対するオプシン標識率の自由な制御に対して、NGS解析・酵母遺伝子工学・機械学習を用いて取り組み、酵母およびヒト培養細胞において、任意のオプシン標識率を達成できる可能性が示唆された。本結果は、オプシン以外の任意のエフェクター遺伝子にも適応できると考えられ、様々な系におけるシングルセル解析を可能にすると期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度までに、「機能的セルオミックス法」の核である「光活性型オプシンの発現パターンのランダム化」が実現可能であることを示した。また、「オプシン発現パターンがランダム化した」線虫ライブラリーを用いて、線虫の産卵行動に関わるニューロンの同定に成功してきた。一方で、線虫ニューロンに対するオプシンの発現率は約30％と高く、複雑な神経ネットワークの機能同定が難しいという問題点があった。そこで、オプシン標識率の自由な制御に取り組んできた。申請者の構築している「機能的セルオミックス法」では、DNA組換え酵素であるCreがどの程度の割合でlox2272配列を認識し、切断するかに依存している。そのため、lox2272配列にCre認識率を変化させる変異を加えることで、標識率を自由に制御できると考えて、実験を行った。そこで、PCRにより、lox2272配列に対して網羅的に変異導入を行い、変異lox2272配列ライブラリーを構築した。その後で、各変異配列をCre切断させ、個々の変異配列の切断率をNGSで評価したところ、数千以上の変異体を評価することができた。さらに、評価した各変異配列と対応するCre切断率を学習データとして機械学習モデルを構築した。この機械学習モデルでテストデータを評価したところ、極めて高い予測性能を示した。このモデル用いることで、オプシン標識率を自由に制御できると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、任意のlox2272配列のCre切断率を予測可能な機械学習モデルの予測精度をさらに向上させるべく、qPCRを用いて新規に取得したデータを機械学習の学習データに追加し、再度学習を行わせ、機械学習モデルの最適化を行っていく。機械学習モデルの最適化が完了した後は、これまで酵母・培養細胞を用いて行っていたアッセイ系を線虫に移し、線虫において、オプシン標識率を変異lox2272配列を用いることによって自由に制御可能になることを実証する。最後に、オプシン標識率が制御された線虫ライブラリーを用いて、これまでに実証した線虫産卵行動よりも複雑な神経ネットワークによって制御されていると考えられる線虫接触刺激に関与するニューロン群の個別制御による個々のニューロン機能の同定を行うことで、複雑な神経ネットワークの機能解明が可能であることを実証する。
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