| 研究課題/領域番号 |
20J23072
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
福本 紘大 大阪大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| キーワード | DNAオリガミ / 1分子イメージング / クライオ電子顕微鏡 / モータータンパク質 / RNAポリメラーゼ |
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| 研究実績の概要 |
遺伝子発現は生物の基本的な機能である。近年、真核生物の核内におけるクロマチン構造や核内構造との相互作用が遺伝子発現の制御に寄与することが示されてきたが、反応場の分子配置を制御することが難しかったため、詳しい分子機構は未解明であった。本研究の目的は、空間配置をナノメートル精度で制御可能なDNAオリガミの構造上に転写の反応場を構築することで、反応場の分子配置が遺伝子発現に与える影響を評価することである。本年度では、当該研究を達成するために必要な2つの解析技術の開発を行った。
まず、蛍光1分子観察の系を用いて、DNAオリガミ上に結合させたタンパク質の配置の影響を評価できることを確かめた。本研究では、蛍光1分子観察とDNAオリガミ技術を利用し、遺伝子発現反応の空間配置の影響を評価する計画である。本年度は、以前より取り組んできたモータータンパク質キネシンの系を応用し、DNAオリガミ上に結合させたタンパク質の配置の影響が蛍光1分子観察で解析できることを示した。特に、タンパク質の配置を近づけたとき、立体障害によりタンパク質の機能が阻害されることを示した。
加えて、DNAオリガミを含む粒子の構造評価を行った。本研究では、DNAオリガミ上に結合させた分子の空間配置の影響を調べる計画である。これを達成するためには、DNAオリガミ上に結合させた分子の空間配置の違いを実験的に計測する必要がある。本年度は、DNAオリガミ粒子および、その粒子に結合させたモデル分子リボソームの構造を解析できることを示した。また、解析のために必要な、DNAオリガミにタンパク質を結合させた複合体を調製するための精製方法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の大部分は共同研究先の上海科技大学 (中国) で実施する予定であったが、新型コロナウイルスの影響で渡航が困難になったため、計画通りに研究を進めることができなかった。渡航が制限される中で当該研究を達成するため、本研究に必要となる2点の技術的課題の解決に取り組んだ。
1点目の蛍光1分子観察の実験系に関しては、モデルタンパク質キネシンを用いて、DNAオリガミ上での分子配置の影響を評価することは達成することができた。一方、実験設備または材料へのアクセスが困難であったため、蛍光1分子観察を用いて転写関連因子の評価をすることはできなかった。
2点目のDNAオリガミ粒子の構造解析の実験系に関しては、DNAオリガミ粒子を評価する実験系を確立できた点で、期待通りの進展があった。一方、DNAオリガミへのRNAポリメラーゼの非特異的吸着が想定以上に多いことが分かり、DNAオリガミ上にRNAポリメラーゼを結合させた複合体の調製方法の開発には時間がかかることが明らかになった。そこで、転写反応と共役する分子であるリボソームを用いて精製・構造解析手法の開発に取り組んだ。リボソームを用いることで、期待通り精製・構造解析の実験系を確立することができた。
以上の結果から、計画通りに研究を進めることはできなかったが、代替因子を用いた系の確立ができたと評価する。
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| 今後の研究の推進方策 |
現状では、DNAオリガミ上にRNAポリメラーゼを結合させた複合体の調製が困難であると分かった。そこで、本年度で実験系が確立されており、転写反応と共役する分子でありリボソームの系を基に研究を進める。今後は、DNAオリガミ上に複数のタグ結合手を配置し、最適な空間配置でリボソームを含む超分子の解析を行う。これを実現するに当たり、超分子を複数個所で捉えるための低親和性のタグ結合手の検討が課題であり、その解決を試みる。技術的な課題が解決できれば、リボソームに活性制御因子が相互作用した複合体をDNAオリガミ上に結合させ構造の評価を行う。また、進捗によっては、転写翻訳複合体の精製と構造解析にも挑戦する。これらの研究を通して、遺伝子発現反応における分子配置の影響を明らかにする。
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