| 研究課題/領域番号 |
20J23426
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
平島 眞吾 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| キーワード | 核酸 / 蛍光ヌクレオシド / FRET / フェルスター共鳴エネルギー移動 / ヌクレオソーム |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、蛍光性核酸塩基からなるFRET系による、ヌクレオソームと呼ばれるDNA-タンパク質複合体の構造解析を目的とする。そのため、我々は蛍光塩基を開発し、それを用いたFRET系を構築した。当該年度は(1)二本鎖DNA中でのFRET系の構築と評価に関する論文の投稿、(2)FRETペアを組み込んだヌクレオソーム調製法の確立とFRETの観察、(3)フッ素を含むヌクレオシドの合成と物性評価を行った。
(1)本課題開始前に得られた結果の考察や追加実験を進め、論文を投稿した。当該年度の9月にJ. Phys. Chem. B誌に受理された。
(2)我々のFRETペアを組み込んだDNAを固相合成法により化学的に合成した。当初は酵素による合成を試みたが 、収量の低さや除去の難しい不純物が問題となった。化学合成では、修飾を含む配列を我々が合成し、残りの配列の合成を業者に依頼することで、長鎖ながら十分な量のDNAが得られた。本手法は酵素合成の問題点を解消しており、蛍光塩基の導入位置の自由度が高い。今後は化学合成により、様々な配列のDNAを合成して実験で使用する。得られたDNAとヒストンオクタマーからヌクレオソーム再構成を行い、電気泳動により確認した。ドナーのみ、あるいはドナーとアクセプターの両方が導入されたヌクレオソームの蛍光スペクトルを測定し、FRETを観察した。2 nm程度のドナー・アクセプター間の距離が予想される系において、0.25程度の妥当なFRET効率が観察された。
(3)薬剤等としては盛んに研究が進められている含フッ素ヌクレオシドを合成し、それを組み込んだDNAの構造や物性を調べた。その成果は今後論文を投稿する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々は当該年度において、FRETペアを導入したヌクレオソームを用いる実験系を確立した。具体的には、蛍光性核酸塩基を導入した長鎖DNA鎖の合成と、そのDNA鎖を用いたヌクレオソーム再構成に取り組んだ。当初予定していた酵素反応でも目的のDNAは得られたが、収量や純度の観点から最終的には化学合成を選択した。得られた修飾DNAとヒストンオクタマーから再構成したヌクレオソームの蛍光測定も行い、FRETの観察にも成功した。また、蛍光スペクトル測定の装置や条件の検討も行った。今後は、確立した実験系によりヌクレオソームの構造変化の測定を進めることができる。
以上を踏まえ、当該研究課題は順調に進行していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々は前年度にFRETペアを組み込んだ長鎖DNAの調製と、それを用いたヌクレオソームの再構成及びFRETの観察を達成している。今後はFRETペアを導入したヌクレオソームを用いて構造変化の検出を試みる。DNA鎖がヒストンオクタマーから解離するような基本的な構造変化や、タンパク質の結合などにおける動的な構造変化の解析を行う予定である。分子シミュレーションと組み合わせて、実験結果を考察することも検討している。
前年度に合成と物性測定を行った含フッ素ヌクレオシドの研究成果をまとめ、論文の投稿を行う。そのユニークな物性を生かした機能性核酸への応用も検討する。
また、タンパク質とDNAの結合を我々の蛍光性核酸塩基により検出することも試みる。
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