| 研究課題/領域番号 |
20J23653
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
米村 開 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| キーワード | バイオ触媒 / シトクロムP450 / 酸化反応 / 擬似基質 / スクリーニング |
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| 研究実績の概要 |
巨大菌由来のシトクロムP450BM3は、活性中心に鉄錯体を有するヘム酵素で、長鎖脂肪酸の水酸化を触媒する。その触媒活性は極めて高いものの、基質特異性が高く、長鎖脂肪酸以外の基質の水酸化は通常進行しない。一方、我々は、長鎖脂肪酸と類似の骨格を有する鎖長の短い不活性な分子、デコイ分子を添加することで、P450BM3の誤作動を引き起こし、ベンゼンなどの非天然基質の水酸化に成功している。デコイ分子を添加する本反応系を、我々は基質誤認識システムと名付けている。近年では、系統的かつ段階的な小分子スクリーニングにより、より高いベンゼン水酸化活性を引き出すデコイ分子の創製に成功している。本申請課題では、さらなるスクリーニングを通して、ベンゼン水酸化よりも高難度な「ガス状アルカンの直接水酸化を進行させるデコイ分子の創製」に取り組む。また、デコイ分子とP450BM3の相互作用解析により、「デコイ分子の構造がP450BM3の誤作動を引き起こす機構を明らかにすること」を目指す。
当該年度は、まず、既存のデコイ分子ライブラリーを用い、ガス状アルカン水酸化スクリーニングを試みた。スクリーニングでは、ガス状アルカンと似た構造と性質を有し、かつ生成物の検出が容易な代理基質を用いた。スクリーニング結果から、代理基質の水酸化に適したデコイ分子の骨格の傾向が得られた。それを基に、より最適化された新規デコイ分子を再設計したところ、既存のデコイ分子を上回る高活性を野生型P450BM3から引き出すことに成功した。得られた新規デコイ分子を用いて、実際にガス状アルカンの水酸化を行ったところ、やはり高い活性を引き出すことができた。
分子間相互作用解析では、等温滴定型カロリメトリー（ITC）を用い、P450BM3へのデコイ分子の結合の解析を行った。これにより、デコイ分子の結合の駆動力は疎水性相互作用であることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
シトクロムP450BM3によるガス状アルカン水酸化反応は難易度が高いことから、専用のデコイ分子の開発も難航することが予想された。しかしながら、本研究ではそれを僅か一年で達成していることから、当初の計画以上に進展していると評価している。さらに、スクリーニングによりデコイ分子の傾向が明らかになったことから、より高活性なデコイ分子を開発する方策を得ることができた。また、既存のデコイ分子ライブラリーはベンゼン水酸化を志向したものであったが、これを用いてガス状アルカン水酸化を進行させるデコイ分子をも開発できたことから、より幅広い基質の水酸化へとライブラリーの応用が可能であることが示された。ITCを用いた分子間相互作用解析においては、デコイ分子のP450BM3への結合の駆動力を初めて決定することができた。今後、より多くのデコイ分子の測定を行い、その結果を比較することで、詳細な構造活性相関を得ることが期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
当該年度で得られたガス状アルカン水酸化デコイ分子の作用を明らかにする。デコイ分子とP450BM3の結晶構造解析により、デコイ分子が結合した状態の活性部位の構造を決定し、ガス状アルカンの活性部位への固定化様式を明らかにする。また、結晶構造から、基質の取り込み経路について考察する。これらを基に、デコイ分子の改良およびP450BM3への変異導入を行い、水酸化活性のさらなる向上を目指す。ITCでは、測定に最適な条件を決定し、多種多様なデコイ分子とP450BM3の相互作用の解析を行う。その結果を基に、デコイ分子の構造の違いとP450BM3への結合力および引き出す水酸化活性の関係を解明する。
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