| 研究課題/領域番号 |
20J40164
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
岩森 督子 九州大学, 農学研究院, 特別研究員(RPD)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| キーワード | 生殖細胞間架橋 / 精子形成 |
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| 研究実績の概要 |
正常な精子形成において精巣特異的細胞間結合の存在は必須であり、欠損すると雄性不妊を導くが、それらの機能および関連性は不明である。そこで、本研究では精巣特異的細胞間結合の一因子であり、Ectoplasmic Specialization(ES)や 生殖細胞間結合Intercellular bridge(ICB)など複数部位に局在するKIAA1210のノックアウトマウス（KO）を作製し、野生型マウス（WT）の精巣と比較解析を行った。表現型や遺伝子産物の発現・局在において変化が見られ、KIAA1210の機能やICBを含む細胞間結合の精子形成における新たな可能性が示唆された。さらに、KIAA1210－KOとWT精巣タンパク質のプロテオミクス解析、KIAA1210に対する抗体による免疫沈降プロテオミクス解析（IP-Proteomics）を行い、複数の新規遺伝子を選択、抗体作製とノックアウトマウス作製を開始した。また、複数の異なる細胞間結合の関連性を可視化解析するために多重カラートランスジェニックマウス（multi-cTG）を作製し動的解析を行うことによりその関連性を探求することを最終目的に、CRISPR/Cas9システムを用いてノックインマウス作製を目指している。ES細胞に対してCRISPR/Cas9システムで蛍光タンパク質をノックインしようとしたが時間と飼育規模を考慮し、受精卵に直接ノックインする方法に変更・改良し、ノックインマウスの誕生を目指している。研究成果は不妊原因解明や妊孕性診断など医療の他、家畜の繁殖や野生動物の維持など広く応用されることが期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
新型コロナウイルスの影響下で研究ができない期間があったが、データ解析や論文検索など机上でできることを在宅で行い、実験開始後に活かせたことにより研究は概ね良好に進展している。初年度に計画していた研究内容はほぼ全て成果が上がっており、2年目の研究計画にスムーズに進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
1)生殖細胞間架橋関連遺伝子KIAA1210のノックアウトマウスと野生型マウスの精巣における表現型の違いや遺伝子産物の局在変化をより詳細に解析し、KIAA1210の関わる現象のメカニズムを探求する。また、成果報告として学会発表および論文投稿を目指す。
2)KIAA1210のノックアウトマウスと野生型マウスの精巣タンパク質のプロテオミクスおよびKIAA1210に対する抗体を用いた免疫沈降プロテオミクス解析(IP-Proteomics)の結果から、細胞間結合を構成する候補となる新規遺伝子を選択し、抗体作製、ノックアウトマウス作製を開始している。抗体入手順にタンパク質局在解析、動物作製順に表現型解析を開始する。
3)マルチカラートランスジェニックマウスを作製すべく、CRISPR/Cas9システムを用いて蛍光タンパク質をノックインしたES細胞を作製した。 当初はこのES細胞を用いてマウスを作製する計画であったが、キメラマウスを介して作製しなければならず、技術を要し、非常に時間がかかり、実験規模(飼育規模)も大きくなるため、CRISPR/Cas9システムを受精卵に用いて直接ノックインする方法に切り替えて作製を試みている。 CRISPR/Cas9 システムを受精卵に用いる最良の方法を樹立し、本年度中にシングルカラートランスジェニックマウスの誕生を目指す。
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