| 研究課題/領域番号 |
20K02332
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
風見 真千子 東京農業大学, 農学部, 助教 (60761046)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | デハイドリン / 特徴的配列 / 置換変異 / 凍結変性防止効果 |
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| 研究実績の概要 |
天然変性タンパク質であるデハイドリンは、種子形成後期に発現し、植物組織のタンパク質や膜を保護する機能をもつ。デハイドリンのアミノ酸配列上には、いくつかの特徴的な配列の存在が報告されており、近年、その中でもK-segmentと呼ばれる配列が乳酸脱水素酵素の凍結変性防止に寄与している可能性が報告されている。しかし、デハイドリンが食品の物性に与える影響について、特徴的配列に着目し検証された例はこれまでにない。そこで本研究では、大豆由来デハイドリンの部分置換組み換えタンパク質を作製し、食品に対する物性改良効果を比較することで、その作用メカニズムを明らかにすることを目的とした。
令和3年度は前年度に引き続き、PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit（TAKARA）を用いることで、特徴的配列であるK-segment、Y-segment、S-segmentの塩基配列置換を行った。置換に成功したものをタンパク質発現誘導し、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーにて部分置換組み換えタンパク質の精製を行った。精製した部分置換組み換えタンパク質をSDS-PAGEで分離後、CBB染色およびWestern Blotting法に供した。その結果、いくつかの部分置換体において、31kDa付近にバンドが検出され、部分置換組み換えタンパク質の発現に成功したことを確認した。さらに、それらの部分置換組み換えタンパク質の機能性について、乳酸脱水素酵素を用いて評価することに着手した。
各置換体の進捗状況にずれが生じているため、振とう培養器を追加購入する予定だったが、コロナ禍により納期未定の状態が続いており、一刻も早い導入を切望している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の予定よりも部分置換体の組み換えパターンを増やしたことに加え、置換する配列によってはタンパク質発現に苦戦している。より効率的に実験を進めるために、振とう培養器を追加購入する予定であったが、コロナ禍により納期未定の状態が現在も続いている。ボトルネックになっている振とう培養器の追加導入により飛躍的に研究が進むことを期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
部分置換体の組み換えパターンを当初の予定より増やしたことで研究の幅が広がったため、デハイドリンが他のタンパク質機能に与える影響および食品中のデハイドリンの局在と食感との関連性についてより詳細に比較解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和2年度に、コロナ禍で既存および入手可能な試薬等を使用して遂行できる実験を優先したため、当初の予定より部分置換体の組み換えパターンを増やした。それに伴い、令和3年度はより詳細な比較解析が可能になったが、実験の進捗状況としては全体的にやや遅れている。これらの理由により生じた次年度使用額については、令和4年度に行う実験の試薬等の購入費として使用する予定である。
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