| 研究課題/領域番号 |
20K02332
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
風見 真千子 東京農業大学, 農学部, 助教 (60761046)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | デハイドリン / 特徴的配列 / 置換変異 / 凍結変性防止効果 |
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| 研究実績の概要 |
令和２～３年度に計画していた実験が、コロナ禍や世界情勢の影響で一部の試薬および機器の入手に手間取り、計画通りの遂行が不可能になったため、昨年度までに予定していた計画の一部を変更した。
今年度は昨年度に引き続き、本研究の幅を広げる目的で当初の予定より組み換えパターンを増やした。特に、デハイドリンタンパク質のKセグメントと呼ばれる配列については、乳酸脱水素酵素の凍結変性防止に寄与している可能性が報告されており、本課題においても最も着目している配列である。そこで、①KセグメントをYYセグメントに置換、②KセグメントをYSセグメントに置換の２置換体の作製を試みた。これらの置換体は、置換部位が広範囲に渡るため、いずれも４つのステップに分けて段階的に置換を行った。いずれの置換体も、２ステップ目までの変異導入には成功した。しかし、３ステップ目のPCRによる変異導入後にアガロース電気泳動を行った結果、PCR産物が目的の塩基対数である5,500bpではなく8,000～9,000bpに確認されたため、PCRの条件検討、プライマーの再設計等、いくつかの改善策を試みたが成功には至らなかった。そこで、使用する酵素をこれまでのPrimeSTAR Mutagenesis Basal KitからPrimeSTAR GXLなど他の酵素に変更し3ステップ目の変異導入を試みている。一方で、これまでに変異導入に成功したものに関しては、タンパク質の発現誘導を行い、得られた部分置換デハイドリン組み換えタンパク質の機能性評価に着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
昨年度に引き続き、当初の予定よりも部分置換体の組み換えパターンを増やしたため、最終的に研究の幅が広がることが期待できるが、配列によって置換変異に苦戦している変異体がある。また、本研究の遂行において重要な試薬が製造中止になってしまい、代替品の選定に予想以上の時間を要したため、当初の研究計画から遅れている。
以上の理由により、2022年度で完了予定であった本研究課題を1年延長することとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度着手した部分置換体の作製および既に完成している部分置換デハイドリン組み換えタンパク質の発現を行い、それらの性状解析を行う。次いで、それらの部分置換組み換えタンパク質が他の成分に与える影響の解析を行い、最後にタンパク質系食品中における部分置換組み換えタンパク質の局在と食感との関連性を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和2～3年度に、既存およびコロナ禍でも入手可能な試薬等を使用して遂行できる実験を優先したため、当初の予定より部分置換体の組み換えパターンを増やした。そのため、より詳細な比較解析が可能になったが、実験の進捗状況としては全体的に遅れており、結果的に本年度予定していた国際学会での発表や論文投稿には至っていない。これらの理由により生じた次年度使用額については、令和5年度に行う実験の試薬等の購入費、学会発表および論文投稿に使用する予定である。
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