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本研究では、唾液中に含まれているミュータンス菌の中でもcnm/pa陽性ミュータンス菌を短時間に且つ簡便に検出する方法を確立し、cnm/pa陽性ミュータンス菌の保有頻度と対象者背景との関連性を明らかにすることを目的としている。今回、等温で遺伝子を増幅できるLAMP法を用いた検出法の確立に関する研究を行った。
現在までに、cnm遺伝子を検出するLAMP用プライマーの設計を終了しており、精製したDNAレベルで特異的に検出できることを確認している。今回、更に詳細な検討を行った結果、本技術がcnm遺伝子を十分検出できるレベルであることを確認し、その結果を報告した。すなわち、口腔内細菌のうちジンジバリス菌、ソブリヌス菌、カンジダ菌のDNAを鋳型としてLAMP反応を行っても、これらの細菌は検出できなかった。これは、他の細菌と区別して特異的に検出できていることをあらわしている。また、pa遺伝子を検出するLAMP用プライマーの設計も終了しており、精製したDNAレベルで特異的に検出できることを確認している。条件検討の結果、ポリエチレングリコール濃度を8％にすることで短時間に検出することができた。さらに、今回作製したプライマーが、ミュータンス菌以外の口腔常在菌 に反応せず、cnm遺伝子とpa遺伝子のみに特異的に反応することも確認できた。
更に、唾液からの菌の増幅・検出方法についても検討した。すなわち、マイクロチューブ中に、タブレット型に成形した2種類の固形培地と口腔内からサンプリングした唾液を混合し、37℃の恒温槽中に静置した。培養１～２日後、唾液を直接LAMP反応液に添加し、口腔内細菌の有無をLAMPにより増幅した。この結果、ミュータンス菌およびジンジバリス菌を検出できることが確認できた。これは、使用するチューブが1本で済み、抽出操作の時間短縮にもつながるため、汎用的に利用されることが期待できる。
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