| 研究課題/領域番号 |
20K02421
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| 研究機関 | 長岡工業高等専門学校 |
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研究代表者 |
田崎 裕二 長岡工業高等専門学校, 物質工学科, 教授 (90390434)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | マツタケ / 香気生合成機構 / 桂皮酸メチル / 1オクテン3オール / 桂皮酸カルボキシルメチルトランスフェラーゼ / ジデオキシゲナーゼ / 遺伝子発現 / 酵素化学的性質 |
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| 研究実績の概要 |
マツタケの特徴香である桂皮酸メチルは，マツタケとその近縁種のみで検出される．しかし，それ以外のキノコにも桂皮酸メチル生合成に関わるPALとその基質（Phe）は存在する．そこで，マツタケとその近縁種のみで桂皮酸メチルが検出される要因を明らかにするため，マツタケの桂皮酸メチル生合成に関わるCCMTの遺伝子を単離し，その発現様式と酵素化学的性質を調べて，CCMTの機能を解明する．これにより桂皮酸メチル生合成機構の全貌を明らかにする．また，マツタケの全体の香りが，収穫後に減少する理由を明らかにするため，マツタケの主要な香気成分1オクテン3オールの生合成への関与が推測されるDOX遺伝子の発現様式と酵素化学的性質を調べて，DOXの機能を解明する．
2020年度において，マツタケのCCMTの候補遺伝子を単離した．その遺伝子の組換え蛋白質を産出し，CCMTの活性を有すると推測した．また同様に，単離済みの3つのDOX遺伝子の中の2つの組換え蛋白質を産出し，DOXの活性を有すると推測した．これらの結果より，マツタケの主要な香気成分の生合成に関わるCCMT及びDOXの遺伝子の取得に成功したと考えられる．今後は，これらの遺伝子の発現様式と各香気成分の生合成との関係を明らかにする．また，CCMT及びDOXの酵素化学的性質を明らかにする．これらは，桂皮酸メチルがマツタケとその近縁種のみで生合成される要因とマツタケの全体の香りが収穫後に減少する要因を解き明かす大きな手掛かりとなる．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2020年度の計画①『CCMTの遺伝子cDNAとゲノムDNAの単離・配列解読』において，CCMTの基質となる桂皮酸添加及び無添加の培地で培養した菌糸体より抽出したトータルRNAを用いて，純度・断片サイズなどが良好なライブラリーを調製した．各菌糸体で発現する全mRNAの配列解読（次世代シーケンスmRNA-Seq）を実施した．配列解析により，桂皮酸添加で発現量の増加する遺伝子cDNAの中からCCMTの候補遺伝子を1つ選択した．しかし，その候補遺伝子の桂皮酸添加による発現量の上昇が予想より低かったため，2021～2022年度の計画④『組換えCCMT及びDOX蛋白質の産出と性質化』を先行して実施し，その候補遺伝子の組換え蛋白質を産出してCCMT活性を調べた．その結果，この組換え蛋白質は活性を有すると推測された．この計画変更により，ゲノムDNAの単離・配列解読については，研究が完了していない．
上記のCCMT候補遺伝子と同様に計画を変更し，3つのDOX遺伝子の組換え蛋白質を産出し，リノール酸（基質）からの生成物を同定することにより，組換え蛋白質のDOX活性を調べた．その結果，2つのDOX遺伝子では活性を有すること確認でき，残りの1つについては解析中である．以上の計画変更により，計画②『DOX遺伝子のゲノムDNAの単離・配列解読』及び計画③『CCMTとDOXの遺伝子の発現量測定』については，研究が完了していない．
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| 今後の研究の推進方策 |
マツタケの特徴香である桂皮酸メチル及びマツタケ全体の香りに関わる1オクテン3オールの生合成機構を解明するため，2021年度においては，単離したCCMT遺伝子及びDOX遺伝子のゲノムDNA配列解析を実施する．また，マツタケの菌糸体及び子実体において，これらの遺伝子の発現様式と桂皮酸メチル及び1オクテン3オールの生合成との関係を明らかにする．さらに，CCMTとDOXの組換え蛋白質を産出・精製し，それらの酵素化学的性質を明らかにする．これらの目的を達成するため，以下の①～④の研究の実施を予定している．また，2020年度の計画を変更したが，未完了の内容を2021年度に実施し，研究内容に関しては変更せずに，研究を遂行する．
計画①『CCMTの遺伝子cDNAとゲノムDNAの単離・配列解読』 2020年度に単離したCCMTの候補遺伝子のcDNAとゲノムDNAの配列解読を実施し，その遺伝子の構造を明らかにする．
計画②『DOX遺伝子のゲノムDNAの単離・配列解読』 3つのDOX遺伝子のゲノムDNAの配列を解読し，DOX遺伝子の構造を明らかにする．
計画③『CCMTとDOXの遺伝子の発現量測定』 CCMTとDOXの遺伝子の転写量をリアルタイムPCR法で測定する．試料には子実体の生長過程，各部位，収穫後保存した子実体及び香気成分の材料が供給された菌糸体から抽出したトータルRNAを用いる．これにより，マツタケの子実体と菌糸体における各遺伝子mRNAの発現の量，場所，時期，誘導といった発現様式を明らかにする．
計画④『組換えCCMT及びDOX蛋白質の産出と性質化』 2020年度において，大腸菌発現系により産出したCCMTとDOXの組換え蛋白質の精製方法を確立する．その後，組換え蛋白質の最適pH・温度，反応生成物等を調べて，それらの酵素化学的性質を明らかにする．
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