| 研究課題/領域番号 |
20K03877
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
長友 重紀 筑波大学, 数理物質系, 講師 (80373190)
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| 研究分担者 |
中谷 清治 筑波大学, 数理物質系, 教授 (00250415)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | シリカゲル / 細孔 / ヘムタンパク質 / ミオグロビン / 拡散 / 蛍光 / 共焦点顕微鏡 / 亜鉛 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度の研究成果（シリカゲル細孔内に球状タンパク質という点で構造が似ているミオグロビンが入っていることをレーザ共焦点顕微鏡を用いた蛍光測定により確認したこと）をもとに，本年度は，シリカゲル細孔内のTHz領域のスペクトルを得るための測定系を，顕微鏡を基本に構築した．プローブ光となるレーザ光を光ファイバーを用いて対物レンズへ導入し，ミオグロビン溶液中に入れたシリカゲル粒子（粒径約60μm）で焦点が合うようにし，散乱光も同じ対物レンズで集光し，光ファイバーを用いて分光器，検出器へ光を導くように設計した．また，粒子に集光したレーザ光が当たることを確認するために，レーザ光が集光された位置を確認した後，接眼レンズを用いて，シリカゲル粒子の位置を目視できるようにもしている（接眼レンズでシリカゲル粒子を目視しているときは安全のためにレーザ光を消去している）．昨年度の研究成果より，ミオグロビンの希薄溶液（ヘム濃度で数μM）にシリカゲルを入れて平衡状態に達するとシリカゲル内でのミオグロビン濃度は1000倍程度に濃縮された状態になるので，レーザ光がミオグロビンの入ったシリカゲルに照射されているか，あるいは位置がずれて溶液に当たっているかについて区別ができるはずであり，実際に蛍光を発するように亜鉛でヘム鉄を置換した亜鉛再構成ミオグロビンでは両者の蛍光強度の違いを観測している．この測定系をシリカゲル細孔内のTHz領域スペクトルの測定に用いる予定で進めている．
一方，昨年度に報告したシリカゲル細孔内に亜鉛再構成ミオグロビンが入る（分配），出る（放出）過程の観測については，緩衝溶液濃度を変える（このことは平衡時におけるミオグロビンのシリカゲル粒子内とシリカゲル粒子外（=バルク溶液）の分配比に影響を与える）実験も行い，投稿論文としてまとめた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は，シリカゲル細孔内のTHz領域のスペクトルを得るための測定系の構築について，顕微鏡を基本に据えて実施した．後述するようにバルク溶液中からシリカゲル細孔に入ったミオグロビンの濃度などの特性が分配比から明らかになったので，蛍光強度の比較からシリカゲル内に入っているタンパク質（ミオグロビン）にレーザ光が照射できていることも確認できている．今年度は，この測定系をシリカゲル細孔内のTHz領域スペクトルの測定に用いる予定で進めている．
また，昨年度報告したシリカゲルの細孔内にミオグロビンが入っていく過程と抜けていく過程の両方を，レーザ共焦点顕微鏡を用いた蛍光強度の増大と減少をそれぞれ観測し，シリカゲル細孔内にヘムタンパク質であるミオグロビンが可逆的に出入りできる過程について緩衝溶液濃度を変える実験も行い，緩衝溶液濃度が高いと，ミオグロビンが平衡時にシリカゲル粒子内に入る量が減少する（分配比（= シリカゲル粒子内濃度/シリカゲル粒子外濃度）が小さくなる）ことも確かめて投稿論文として報告した．分配比については，シリカゲル1粒子内に入ったミオグロビンの吸光度を倒立型顕微鏡を用いて実測している．このように，シリカゲル粒子内のタンパク質の挙動を明らかにしたことは，本研究課題である「低誘電率細孔内に閉じ込めたヘモグロビンの機能とそのTHz,GHz主鎖振動の観測」の基礎データを提供するものであり，重要な成果と考えている．これらのことから「(2)のおおむね順調に進展している」と評価した．
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| 今後の研究の推進方策 |
顕微鏡を基本に構築した測定系を用いてシリカゲル細孔内のTHz領域スペクトルの測定を進める．この一環としてシリカゲル細孔内のヘモグロビンの顕微共鳴ラマン分光も実施し，ヘモグロビンの機能と密接な関連があると考えられているFe-His結合（ヘム鉄と配位している近位ヒスチジンの配位結合）の伸縮振動とヘムの伸縮，変角振動を測定し，すでにある水溶液（バルク）の結果と比較することで，シリカゲル細孔内にあるヘモグロビンの構造を推定し，シリカゲル細孔内におけるヘモグロビンが機能（酸素親和性）を維持し得るのかどうかを検討する．一方，シリカゲル粒子内のヘムタンパク質（ミオグロビン）の挙動もかなりわかってきたので，（新型コロナ感染防止のため出張が行えず実施できていなかったが）以前に共同研究等で実施したテラヘルツ時間領域分光法（THz）あるいはサブテラヘルツ帯ネットワークアナライザー（GHz）の実験も行う予定である．
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