| 研究課題/領域番号 |
20K04310
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
上松 天 大阪大学, 工学研究科, 招へい研究員 (10867774)
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| 研究分担者 |
西橋 勉 大阪大学, 工学研究科, 招へい研究員 (00517469)
木村 正 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (90240845)
瀧内 剛 大阪大学, 医学部附属病院, 助教 (40733358)
佐治 史惠 大阪大学, 医学部附属病院, 技術職員 (40600987)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 凍結乾燥 / 氷晶径 / 精子 |
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| 研究実績の概要 |
まず、微噴結乾燥装置において、ヒト精子に損傷を与えずにノズルから噴霧する条件を探索した。噴霧する流量が大きいと精子の運動率が大きく低下すること、流量が小さいとノズル出口で凍結して閉塞することが判明し、検討の結果、50μmのオリフィスノズルで流量0.75mL/minという噴霧条件が適当と判断した。この条件では、噴霧により精子の運動率は62%に低下する。
次に、噴霧凍結した氷粒子の氷晶径を調べるため、精子用の様々な培地を噴霧凍結乾燥した粒子の断面観察を試みたが、粒子が多孔質で非常に脆く、粒子の樹脂包埋時に崩壊するため、断面観察による氷晶径の観察は断念した。代替手段として、噴霧凍結した氷粒子に対してその場でラマン分光測定を行い、ピークシフトによる氷の結晶／アモルファス状態の判別を試みた。その結果、噴霧凍結した氷はアモルファスではなく結晶化していると判明した。
また、様々な凍結保護剤を使用したが、現状、噴霧凍結乾燥後の精子は全て運動能を消失している。その原因を調査するため、噴霧凍結のみで乾燥をしていない精子の運動性を観察すると、運動能が消失していると判明した。噴霧凍結後に樹脂包埋して超薄切した精子を透過電子顕微鏡で観察したところ、頭部細胞膜が損傷している精子が多く見られ、この細胞膜の損傷が運動能消失の原因である可能性がある。この損傷については今後観察検体数を増やしてより明らかにしていく。
また、噴霧凍結乾燥後の精子に対し、JC-1染色による評価を行い、ミトコンドリア活性が消失していることを明らかにした。一方、コメットアッセイによるDNA断片化の評価も行ったが、噴霧凍結乾燥後の精子DNAの断片化は確認されていない。このことは、噴霧凍結乾燥後の精子が少なくとも顕微授精には使用できる可能性を示している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
微噴結乾燥装置における氷晶径の制御および精子の凍結乾燥保存を目指して、まずは精子に適した噴霧条件を探索し、50μmノズル・流量0.75mL/minという噴霧条件が適当と判断した。
次に、噴霧凍結時の氷晶径を制御するために、ノズル孔径を50, 30, 15μmに調整して液滴径を変更することで、凍結速度を制御した。氷晶径の直接的な観察には至らなかったが、氷粒子に対してラマン分光測定を行い、ラマンピークシフトによる氷の結晶／アモルファス状態の判別を試みることで、氷粒子はアモルファスではなく結晶化していることを明らかにした。
現状、噴霧凍結乾燥後の精子は運動能を維持していないが、乾燥前の噴霧凍結の時点で精子が全て運動能を消失していると判明した。その原因は頭部細胞膜の損傷にあると考えられ、今後原因をさらに追究していく。
また、噴霧凍結乾燥後の精子について、運動能以外の評価も実施し、ミトコンドリア活性が消失している一方、DNA断片化は見られないことを確認した。
以上、一部手法に変更はあるものの、おおむね計画通りに研究を進めることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、噴霧凍結で精子が運動能を消失する原因を追究する。これまでの観察結果から、精子頭部細胞膜の損傷が原因である可能性があり、観察検体数を増やしてより明らかにしていく。
また、液滴の凍結速度あるいは到達温度によって、精子の損傷程度が異なるかを評価する。具体的には、液滴が小さく凍結速度が速い方が噴霧凍結時の損傷を抑えられると判明した場合には、さらに小さな孔径のノズルを使用して噴霧凍結した精子の評価を実施する。また、噴霧凍結した氷粒子を回収する場所を液体窒素で冷やす機構を追加し、氷粒子の到達温度が精子の損傷程度に影響するかを評価する。
さらに、現在の評価手法では噴霧凍結乾燥後の精子のDNA断片化は見られていないが、精子のDNAに適さない手法である可能性があるため、別の評価手法も取り入れる。
噴霧凍結時の氷晶径の評価については、凍結後に氷晶が成長している可能性があるため、ラマン分光測定部を液体窒素で冷やす機構を追加し、凍結時の氷晶により近い状態を観測する。
以上の試みにより、噴霧凍結における氷晶を小さくすることで精子の損傷が抑えられた場合は、次に乾燥時の氷晶成長および精子の損傷を抑える検証を実施し、精子の凍結乾燥保存を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定になかったラマン分光器用レーザーを購入するために50万円を前倒し支払い請求したが、その他の物品費等は当初計画より抑えられたため、残額が生じた。
この残額は令和3年度分の助成金と合わせ、研究に必要な消耗品購入や精子の観察サンプルの作製費、研究成果を発表する学会参加費や論文投稿費として使用する予定である。
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