| 研究課題/領域番号 |
20K04521
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
松山 哲也 大阪府立大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (70347508)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ライブセルイメージング / プラズモン共鳴 / 光毒性 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，表面プラズモン共鳴による蛍光増強効果を利用した高感度ライブセルイメージング装置を開発し，レーザー光を生細胞に照射した後の生細胞の動態を詳細に観察することにより，光毒性の発生機構を解明することを目指している．令和3年度は，電子線描画装置を用いて金属微粒子パターン構造を持つ生細胞培養基板を作成するとともに，波長375nm，405nmのレーザー光の光毒性の定量的な比較を行った．
細胞培養基板の作成においては，基板上に様々な形状，直径，間隔，周期構造を持つ金属微粒子を配置した構造に対して時間領域差分（FDTD）計算を行い，プラズモン共鳴波長や電場の染み出し距離を求め，細胞培養基板に適した金属微粒子パターン構造の最適化を行った．さらに，得られた知見をもとに，電子線描画装置を用いて実際に細胞培養基板を作成した．走査型電子顕微鏡で作成した構造の観察，ハイパースペクトルカメラを用いたスペクトル評価を行い，基板処理やドーズ時間などの電子線描画プロセスの最適化を行った．
光毒性の定量評価においては，生細胞の細胞核中心に波長375nm，405nmのレーザー光を照射し，その後の照射部への細胞増殖核抗原（PCNA）の集積と24時間細胞生存率を評価し，光毒性の波長依存性について調べた．集積度の評価方法を再検討した結果，いずれの照射レーザー光強度においても波長405nmに比べ，波長375nmのレーザー光の照射部でPCNAの集積度が高くなり，より短波長である375nm光の方が405nm光よりも光毒性が強いことが確認された．また，波長375 nmでは強度と共に輝度比も増加し続けたが，波長405nmでは飽和の傾向が見られた．24時間細胞生存率や半数致死に至るレーザー光強度と比較して，波長375nmと波長405nmのレーザー光照射では光毒性の発生機構が異なる可能性を示した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和3年度においては計画通り主に電子線描画装置を用いて金属微粒子パターン構造を持つ生細胞培養基板の開発を行うとともに，波長375nm，405nmのレーザー光の光毒性の定量的な比較を行った．金属微粒子パターン構造を持つ細胞培養基板について，FDTD計算を用いて蛍光タンパク質に対する構造最適化を行うとともに，実際に電子線描画装置を用いて最適化した金属微粒子パターン構造を作製し，描画プロセスの最適化を行った．また，レーザー光照射による光毒性の評価方法について検証し，光毒性の波長依存性について定量的な評価を行った．令和4年度には，作製したランダム微粒子構造，金属微粒子パターン構造を持つ細胞培養基板上で実際に細胞培養を行い，既存の蛍光顕微鏡を用いて細胞観察を行うことにより蛍光増強効果について調べ，光毒性の評価に用いる予定である．マシンタイムの関係などにより，電子線描画装置を用いた金属微粒子パターン構造の作成において，描画プロセスの最適化に時間がかかり，実際の細胞観察が令和4年度の実施予定になるなど部分的には若干遅れている箇所はあるが，全体としては概ね順調に進展していると言える．
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度においては，これまでに得た知見を基に，金属ランダム微粒子構造，金属微粒子パターン構造を持つ細胞培養基板上で実際に細胞培養を行い，ライブセルイメージングにより得られる蛍光強度を比較することにより，表面プラズモン共鳴を用いたライブセルイメージング装置の評価を行う．さらに，蛍光増強度の測定結果から，蛍光タンパク質の蛍光増強に適した構造のさらなる最適化を図る．また，光毒性の定量評価についての研究も並行して行い，レーザー光照射による光毒性の照射位置依存性や細胞周期依存性について調べ，研究期間中に得られた知見をまとめ，学会発表や論文作成を行う予定である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症の影響による海外製品の在庫，納期の関係などにより購入物品の選定が進まなかったこと，参加した全ての学会がオンライン開催となり旅費が不要になったこと，年度末までに論文の投稿準備が完了しなかったため校閲費が不必要になったことなどにより支出が減ったため次年度使用額が生じた．令和4年度においてプラズモン共鳴を利用したライブセルイメージング装置開発のために必要な物品の選定などを行い支出する予定である．
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