| 研究課題/領域番号 |
20K05226
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
金岡 英徳 名古屋大学, 工学研究科, 助教 (30631973)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / DNAメチル化 / ストレス応答 / DNA修復 / 蛍光イメージング |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではDNAメチル化を主な指標として、ニワトリ始原生殖細胞（PGC）のエピジェネティクスの状態を蛍光イメージングやDNAシーケンスにより捉え、環境ストレスがニワトリの量的形質を制御する遺伝子にどのような影響を与えるのかを解析する。本年度は、培養細胞において環境ストレスを検出するプローブとDNAメチル化を検出するプローブの改良を行なった。
DNA修復因子であるRAP80を利用したプローブでは、環境ストレス（DNA損傷）依存的なシグナルを検出するため、蛍光タンパク質Venusを分割したBiFC (Bimolecular fluorescence complementation)タイプのプローブを構築した。RAP80とDNA損傷依存的な相互作用が報告されている翻訳後修飾因子SUMOに着目し、それぞれにVenus断片を融合することによりBiFCプローブとした。eGFPをRAP80にそのまま融合したプローブとBiFCプローブを比較した結果、DNA損傷マーカーγH2AXとの局在率の向上し、わずかではあるが損傷依存的な蛍光の増加が観察されたことから、環境ストレスへの応答性を改善できた。
一方、DNAメチル化を検出するプローブとして作製したMBD (methyl-CpG-binding domain)と蛍光タンパク質mCherryを融合したコンストラクトは、高いバックグラウンドが問題となったため、mCherryの融合位置やリンカー長などの検討を行なったが、未だ改善は見られていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
MBD (methyl-CpG-binding domain)を利用したDNAメチル化検出プローブのバックグラウンドが高く、メチル化DNAの濃縮に至っていない。環境ストレス（DNA損傷）応答のプローブは検出感度の向上が見られたため、こちらのプローブを応用したメチル化DNAの検出法も検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請書の実験計画に基づいて、以下の検討項目課題を行う。
・mCherry-MBD（メチル化DNAプローブ）の改良を引き続き行い、感度良くメチル化を検出可能なプローブの開発を行う。
・環境ストレスに応答するBiFCプローブをPGCに導入し、さまざまなストレスに対する応答を検出する。
・メチル化DNAプローブの改良が進まなかった場合は、環境ストレスに応答するBiFCプローブを応用することにより、細胞のストレス応答に伴う蛍光シグナル周辺のラベル化を試みる。ラベル化が可能であれば、アフィニティー精製を用いて、周辺ゲノムのメチル化状態の解析、およびストレス応答因子の解析を行う。
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