| 研究課題/領域番号 |
20K05233
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
河邉 佳典 九州大学, 工学研究院, 准教授 (30448401)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 微細藻類 / クラミドモナス / 人工遺伝子発現システム / ゲノム操作 / Cre-loxP / 人工転写活性化因子 / 藻類バイオテクノロジー / 人工遺伝子回路 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は以下の検討項目を中心に研究を進めた。
前年度までに安定的外来遺伝子発現可能なファウンダー細胞株（Chlamy/S）を樹立した。この細胞は起点となるloxP配列を核ゲノム中に有しているため、外来遺伝子を同じゲノム場所にCre-loxPシステムで導入可能である。そこで、IFN遺伝子発現カセットの導入ならびに薬剤スクリーニングでIFN遺伝子組込み細胞を取得した。培養上清中に生産させたIFNをウエスタンブロットで解析したところ、目的分子量サイズで検出できた。30日間長期培養したところ、選択圧がない状態でも初期培養時の発現量を維持できた。このことから、開発した細胞株では、外来遺伝子の安定発現細胞株の迅速な構築が可能であり、組換えタンパク質や高機能有用物質の生産ホストとしての利用が期待できる。
一方、微細藻類クラミドモナスにおけるさらなる高発現システムの開発を目的に、人工遺伝子発現システムの構築を行った。前年度までにクラミドモナスに適した人工遺伝子発現システムの迅速評価モデルを構築していた。そこで、同評価モデルを用いて検討したところ、クラミドモナスで最も高発現を誘導する既往の遺伝子発現制御領域を使用した場合と比較して、3倍以上高い発現を誘導可能な人工遺伝子発現系が開発できた。この際用いた人工転写活性化タンパク質のDNA結合領域の特性を生かして、添加薬剤による発現を評価したところ、濃度依存的な遺伝子発現制御が達成できた。これらのことは融合パートナーを変えることで、さらに複雑な遺伝子発現調節ができることを示唆しており、藻類でのゲノム工学技術の応用展開が見込まれるものとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
非選択圧下で安定して高いgLuc遺伝子発現を示す組換え細胞株（Chlamy/LS）を樹立した。樹立細胞の核ゲノムDNAを解析し、外来遺伝子のゲノム挿入部位を同定することができた。ファウンダ―細胞Chlamy/Sを作製後、目的遺伝子（インターフェロンIFN）を導入し、長期間発現量を解析したところ、安定的に発現しており、開発した細胞株の優位性を示すことができた。ゲノム改変が容易なCre-loxPシステムを用いた遺伝子導入ならびに外来遺伝子の安定発現が示されたことで、より複雑な遺伝子発現系をゲノムDNA上で設計可能であることを示しており、これまで藻類では難しかったデザイナー細胞開発の足がかりになりえる。また、微細藻類に適した人工転写活性化因子の開発と人工遺伝子発現システムの構築を行った。クラミドモナスに適した人工転写活性化因子を明確にでき、高い発現誘導可能な人工遺伝子発現系が構築できたことから、クラミドモナスにおけるゲノム工学に必要な操作ツール基盤を着実に整備することができた。これらの成果の一部は、論文として公表した。また、複数の関連する学会に報告した。これらのことから本年度は概ね順調に計画書に基づいて進展させることができ、目的を達成することができたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請書の実験計画に基づいて、以下の検討項目課題を行う。
・外来遺伝子高発現システムの開発
・遺伝子改変ツールボックスを用いた人工遺伝子ネットワークの設計
・人工的な細胞デザイン化によるスマートマイクロアルジェの創製
・有用物質生産への応用展開とロバストな汎用技術実証
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