| 研究課題/領域番号 |
20K05235
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
村上 明一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (00733635)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | VHH / 2量体化VHH / 結合様式 / 低分子抗原 / 特異性 / 親和性 / 抗体 / ファージディスプレイ法 |
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| 研究実績の概要 |
単ドメインで抗原と結合できるVHH抗体には欠点がある。その一つが「低分子抗原に対する親和性と特異性の低さ」であり、VHH抗体の「安定性の高さ、生産性の良さ」などの利点を温存し、かつ、低分子抗原に対しても十分な親和性と特異性を有するヘテロ2量体化VHH抗体（Dual-VHH抗体）の研究を進めている。Dual-VHH抗体は、異なる2つのVHH抗体で低分子抗原を「挟み込む」形で結合することにより低分子抗原に対しても十分な親和性と特異性を獲得すると考えた。既に20憶の多様性からなるDual-VHH抗体提示ファージライブラリーを構築し、低分子モデル抗原として使用したFluorescein-4-isothiocyanate（FITC）に結合するクローンの取得を試み、成功した。このクローンの詳細な解析により、2つのVHH抗体の協調により「挟み込み」型で結合していることが示唆されている。VHH抗体の分子量は約12.5kDaであり大腸菌を用いた大量生産が可能であるが、本研究により、2量体化することでその生産量が激減する、もしくは、精製度が低くなることが判明した。そこで、新たにピキア酵母の生産系を導入し、発現ベクターの構築から発現・精製の最適化を進めた。その結果、Dual-VHH抗体が問題なく高純度で生産できることが確認された（≧10mg/L）。現在、取得済みの抗FITC-Dual-VHH抗体の結合様式を構造結晶解析により確認することを目的とし、高純度の抗体タンパク質を十分量調整し、抗原であるFITCとの共結晶化を進めている。また、このDual-VHH抗体の実用化を目指し、低分子抗原と位置付けている脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)や甲状腺ホルモンであるサイロキシン（T4）、トリヨードサイロニン（T3）に対する抗体スクリーニングを開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究が遅れている最大の理由は、本研究当初に所属していた琉球大学大学院医学研究科から2021年7月1日に徳島大学大学院医歯薬学研究部に移動したことにより、研究環境が大きく変化したことによる。さらに新型コロナウイルス感染症に係る規制により、新規な研究体制の構築に想定上の時間を要したが、現状ではサンプル、消耗品、備品等の移管も完了し、本研究を遂行できる十分な体制が構築できた。
実際の研究内容に関しては遅れているものの、概ね実験計画に基づき進めることができている。また、大学を移動したことで人脈が増え、構造結晶解析の専門家との新たな繋がりを得ることができたことから、本研究がさらに発展していくと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
新たにピキア酵母の抗体発現系を導入したことで、純度の高い抗体を容易に調整することができる様になったことから、当初の計画に基づいて研究を推進する。すなわち、Dual-VHH抗体が、本来の単ドメインVHH抗体が有する熱安定性やタンパク質変性剤に対する耐性等の利点を保持しているかの検討を進める。さらに、X線結晶構造解析で直接的に観察することにより、Dual-VHH抗体が低分子抗原に結合する際の、新規な結合様式が明らかにする。また、このDual-VHH抗体の実用化を目指し、低分子抗原と位置付けている脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、甲状腺ホルモンであるサイロキシン（T4）、トリヨードサイロニン（T3）、さらに、より低分子である(4-hydroxy-3-nitrophenyl)acetyl (NP)をモデルハプテン抗原として使用して特異的に結合性を有するDual-VHH抗体の取得を開始しており、得られた抗体について、特異性や親和性の解析に加え、結合様式の解明を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究当初に所属していた琉球大学大学院医学研究科から2021年7月1日に徳島大学大学院医歯薬学研究部に移動したが、新型コロナウイルス感染症に係る規制も重なり、新規な研究体制の構築に想定上の時間を要した。よって、本研究が遅れており、次年度使用額が増大した。現時点では、徳島大学において本研究を遂行するための十分な体制を構築できたことから、残金は本年度の予算と合わせて使用する予定です。
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