| 研究課題/領域番号 |
20K05349
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| 研究機関 | 鶴見大学 |
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研究代表者 |
小沼 一雄 鶴見大学, 歯学部, 非常勤講師 (70356731)
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| 研究分担者 |
斉藤 まり 鶴見大学, 歯学部, 助教 (60739332)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 逆相転移 / アパタイト / リン酸八カルシウム / ACP / 根面う蝕修復 / 細胞とACPの相互作用 / 構造変調型アパタイト |
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| 研究実績の概要 |
本申請課題のテーマは全て成功裏に終了しているため、アモルファスリン酸カルシウム(ACP)の生体内利用の可能性をより深く検証する目的で、下記に関して課題を拡張した追加研究を行っている。
1) ACP基板上に細胞が産生する石灰化物の形態制御
研究代表者が開発したACPナノ粒子圧縮成形基板を、実際の体内における歯骨再生研究に利用するため、基板上に形成するアパタイト(HAP)の形態を詳細に調査した。具体的には骨芽細胞に分化するKUSA, C2C12細胞の両者と、象牙芽細胞に分化するPPU-7細胞を基板上で培養し、細胞が如何なる形態及び組成のHAPを産生するか、TEMと全遺伝子解析を併用して検証した。その結果、HAPの形態に最も影響を及ぼす細胞産生タンパク質はbone morphogenetic protein (BMP)であり、BMPを産生しない象牙芽細胞培養下でも、培地中にBMPを添加すれば、細胞産生HAPの形態は骨芽細胞が産生するHAPと同様の、ナノファイバーと薄板の複合体になることが判明した。この事実は、ACPと適切なタンパク質を用いて体内のあらゆる硬組織の形態を制御できる可能性を示唆しており、ACPの硬組織再生に関する有用性を確固なものとした。
2) ACPと細胞との相互作用性検証
1)で利用した骨芽細胞及び象牙芽細胞に関して、「ACP基板との相互作用性」の検証を行った。具体的には、それぞれの細胞が分化過程で基板上にどの程度生着するかの時間分割測定を試みた。その結果、象牙芽細胞は骨芽細胞に比べて基板上への生着量が少ないことが判明した（概算量で半分以下）。ただし、「分化途上のある時間帯において」象牙芽細胞の生着率が急増する期間がある。基板の時間分割X線回折(XRD)測定から、この現象は基板のACP粒子が低結晶性HAPに転移する過程で出現する、構造変調型HAPに起因することを発見した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
これまでの研究実績概要で記したように、初期申請課題の全ては令和3年度までに成功裏に完了している。すなわち、平衡熱力学では予測できない安定相アパタイト(HAP)から準安定相リン酸八カルシウム（OCP）への逆方向相転移を、アモルファスリン酸カルシム(ACP)ナノ粒子基板と溶液中へのフッ素添加量制御によって成功させ、そのメカニズムを結晶構造的に解明した（令和2年度）。更に、骨類似組織形成に不可欠なACPナノ粒子基板へのコラーゲン含有方法を確立し、基板上に逆相転移で形成するOCP結晶構造中への骨組織再生薬剤の担持と、生理環境溶液中での薬剤徐放にも成功した（令和3年度）。
上記の実験過程で、少なくともin vitro条件ではACPの硬組織再生（特に根面う蝕治療）への有効性を確認した。研究代表者は更に、実際の歯骨治療現場におけるACPナノ粒子基板の有用性を評価するべく、生体内での基板の挙動シミュレーション、及び細胞との相互作用検証を行う計画を立案し、令和4年度の追加課題を2つ申請した。
結果的にはこれらの追加研究によって、i) ACP基板上に形成するHAPの最終形態は溶液中のBMPタンパク質によって制御可能なため、ACPナノ粒子はあらゆる硬組織の再生に利用できる可能性がある、しかし、ii) ACP基板と細胞との相互作用は細胞の種類に応じて大きく変化するため、細胞存在下（生体内）で望みの硬組織形成を行うには相互作用を強化する何らかの処置が必要なこと、iii) 細胞とACPの相互作用には、ACPから低結晶性HAPに相転移する過程で特定期間出現する、構造変調型HAPが関与している可能性があること、等を発見した。
申請課題の範疇を超えて新たに得られた知見は、いずれもACPを硬組織治療現場で使用するにあたって極めて重要であり、本研究の進捗状況の観点からは当初の計画を大きく超えた成果と確信する。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度に追加した研究課題に関して以下の知見を得ており、それらを更に発展させるべく新規課題を提案した。
1) ACPナノ粒子基板と骨芽細胞は強く相互作用して、基板上に骨類似HAPを形成する。一方で象牙芽細胞は基板との相互作用が弱く、生着量が非常に少ない。ただし、細胞分化の一時期に基板上で細胞の生着が急増する期間があり、その時の基板表面には構造変調型HAPが形成している。
上記の事実は、「構造変調型HAPを何らかの手段で増産できれば、象牙芽細胞とACP基板との相互作用を強固に保ち、基板を象牙質う蝕修復に有効利用できる」ことを示唆する。既に、このテーマを本申請課題の発展版として令和5年度開始の科研費基盤研究に応募し、採択されている（基盤C: 23K04606)。新課題研究では、まず構造変調型HAPの結晶学的詳細解明を行い、細胞培養環境の「如何なるファクターが同HAPの形成を促進するか」を解明する予定である。
2) 1)の実験過程で、構造変調型HAP上に細胞が産生した低結晶性HAPは、その周囲にACPがナノスケールで連続的に共存する場合において、電子線照射により秒単位で高結晶性HAPに変化することを発見した。
この現象を利用すれば、今日に至るまで不可能だった「HAPを用いた大領域う蝕治療」が可能となるため、現在も詳細な現象解明を継続している。既に本課題の予算の一部を来年度に繰り越して、観察を継続する申請を提出した。また、本現象は現在の歯科治療方法を根本的に変革する可能性を秘めているため、新課題23K04606の主要テーマの一つとしている。こちらも1)と同様に本課題の発展版として研究継続する。
研究代表者は上記の高速HAP形成が、電子線の熱エネルギーにより崩壊・蒸発したACPを母材としてHAPが気相経由で急速成長したと推測しており、世界初の知見となるため学術的意義が極めて高い。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
産業技術総合研究所の共用透過電子顕微鏡(TEM)が、隣接部屋のメインテナンス工事のため、一定期間（約3か月間）使用制限された。このため、予定していたTEM観察が1回分行えず、次年度（令和5年度）への予算繰り越しを申請した。令和5年度では、この予算を使って、構造変調型HAP基板上に細胞が産生した低結晶性HAPに関して、電子線照射による高結晶性HAPへの急速転移確認実験を行う。
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