| 研究課題/領域番号 |
20K05624
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
寺本 英敏 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, グループ長補佐 (60391562)
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| 研究分担者 |
小島 桂 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (40370655)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 遺伝暗号拡張 / カイコ / 構造タンパク質 / ピロリシル-tRNA合成酵素 / 人工アミノ酸 |
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| 研究実績の概要 |
本課題では、ピロリシル-tRNA合成酵素（PylRS）を利用する遺伝暗号拡張手法がカイコで有効であることを示すとともに、導電性等のユニークな特徴をもつ人工アミノ酸を組み込んだシルク繊維の生産を実現させ、構造タンパク質生産ホストとしてのカイコの有用性を実証する。本年度は、以下の研究を実施した。
・ピロリジル-tRNA（Pyl-tRNA）遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え（TG）カイコ（H19）の5令幼虫から絹糸腺を摘出し、ナノポアシーケンサーを用いてPyl-tRNAの発現解析を実施した。しかし、全長の短いtRNAを解析する上での技術的困難さもあり、Pyl-tRNAの発現を確認するには至らなかった。
・tRNAの発現解析と並行して、PylRS変異体遺伝子を絹糸腺で発現するTGカイコ系統（H16）とH19とを掛け合わせた交雑系統（H16×H19）を作出し、その5令幼虫に人工アミノ酸（Z-Lys）を投与してフィブロインへのZ-Lysの導入有無を解析した。質量分析によるZ-Lysの検出を試みたが、フィブロインへの導入を確認するには至らなかった。フィブロインへの人工アミノ酸導入のより高感度な検出手法としてクリック反応による蛍光ラベル化法を適用するため、反応性官能基をもつ別の人工アミノ酸（TCO-Lys）をH16×H19の5令幼虫に投与し、得られたフィブロインへのTCO-Lysの導入有無を現在解析中である。
・別のプロモータを用いてPyl-tRNA遺伝子を発現させるためのコンストラクトを新規に構築し、これを用いて新たなTGカイコ系統（H20）を作出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
交雑系統（H16×H19）でのフィブロインへの人工アミノ酸の導入が確認できず次の段階へと進むことができなかったため、進捗状況はやや遅れていると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
交雑系統（H16×H19）におけるフィブロインへのTCO-Lysの導入有無の確認をクリック反応を用いた蛍光ラベル化法により実施する。また、新たなPyl-tRNA発現TGカイコ系統（H20）を系統化し、H16との交雑系統（H16×H20）を作出する。H16×H20の5令幼虫にTCO-Lysを投与し、蛍光ラベル化法によりフィブロインへの導入有無を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H16×H19系統でZ-Lysの導入が確認できず人工アミノ酸の受託合成を延期した結果として次年度使用額が生じた。翌年度請求分と合わせ、人工アミノ酸の受託合成費等に充てる。
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