| 研究実績の概要 |
本研究では、ヘム代謝における特殊な生成物（特殊ビリン）を蛍光団とするタンパク質を開発し、特殊ビリンの高感度検出とタンパク質ラベル化技術への応用を目指している。今年度はまず、ビリベルジン（BV）結合型蛍光タンパク質、smURFP、とマイコビリン（結核菌の特殊ビリン）の反応を検討した。前年度までに両者の共有結合形成を観測しており、蛍光強度増強を目指してランダム変異を導入したsmURFP遺伝子を大腸菌に発現させ、マイコビリンを塗布した培養プレート上でスクリーニングを行った。現在までに約30,000コロニーを評価したものの、強い蛍光を発するクローンは得られておらず、より大規模な探索や対象残基を絞り込んだ変異導入が必要と考えられる。
ついで、smURFPとスタフィロビリン（SB：黄色ブドウ球菌の特殊ビリン）の反応を検討するため、黄色ブドウ球菌のヘム分解酵素IsdGによるSBの大量調製を試みたが、触媒的な反応条件では新たな生成物が得られることが判明した。そこで新反応の解析を行なったところ、新規生成物ではSBの開環部にホルミル基が保持されており、マイコビリンの位置異性体に相当する。構造の類似性から予想される通り、ホルミルSBの生成はマイコビリンと同様、１原子／２原子酸素添加反応が融合した特殊な機構で進行した。さらに、脱ホルミル反応は速い還元条件で顕著になり、酸素活性化によって進行することも示された。２種の反応の発見により菌体内での脱ホルミル反応に疑問が持たれた。そこでヘムを唯一の鉄源として黄色ブドウ球菌を培養し、培地中からヘム代謝物の直接検出を試みている。現在までの解析では脱ホルミル体と思われる生成物が検出されており、今後、LCMSや同位体ラベル化実験により、その同定を進める予定である。また、ホルミル基の有無による蛍光特性の違いなどを利用し、蛍光タンパク質を利用した検出にも期待される。
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