研究課題
本研究では、放線菌由来チロシナーゼ(Ty)とその金属シャペロンであるキャディー(Cad)からなる複合体を用い、Tyの反応機構と成熟化機構を解明することを目的としている。海外グループの研究により、細胞内でTyは銅イオンよりも多く存在する亜鉛イオンと結合し、不活性状態になっていることが示唆されている。昨年度、野生型複合体を用い、亜鉛イオン存在下でカイネティクス解析を実施した。その結果、銅イオンの方が亜鉛イオンよりもTyに取り込まれやすいこと、および、Cu(I)の方がCu(II)よりも取り込まれやすいことが明らかとなった。野生型CadのY98残基はTyの活性中心に位置し、Tyにより酸化反応を受ける。この残基をフェニルアラニンに置換した場合は、この酸化修飾反応が起こらない。この置換がTyの成熟化に及ぼす影響を調べるため、Y98F変異型Cadと複合体を形成したTyについて、同様の実験を行った。野生型複合体において銅イオンを添加すると、時間の経過に伴い劇的に酵素活性が減弱するのに対し、Y98F変異型複合体では酵素活性の減少が緩やかであった。Cadの酸化修飾が酵素活性の減弱に関わっているといえる。次に、亜鉛イオン存在下でY98F変異型複合体に銅イオンを添加し、所定時間後のTy活性を調べた。その結果、野生型複合体の場合と同様に、亜鉛イオン存在下では、酵素活性が最大化するために必要な時間が増加していた。また、ヒドロキシルアミン非存在下で銅イオンの濃度が低い場合には、野生型複合体の場合とは異なり、酵素活性がほとんど上昇しなかった。このことは、Tyの活性中心金属を亜鉛イオンから銅イオンへ置換するには、Cadの酸化修飾が非常に重要であることを示している。
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