| 研究課題/領域番号 |
20K05717
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
新野 祐介 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 研究員 (10584584)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 蛍光タンパク質 / レポーター遺伝子 / 蛍光イメージング / タンパク質工学 |
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| 研究実績の概要 |
オワンクラゲ由来のGFPに代表される蛍光タンパク質は、補因子なしに蛍光シグナルを得られる利便性から広くレポーター遺伝子として利用されているが、発色団形成に時間を要するため、発現から蛍光性獲得までにはタイムラグがある。そのため、研究対象とする遺伝子発現が短時間のものである場合、従来の成熟の遅い蛍光タンパク質では蛍光を発する前に分解されてしまい、その発現動態に追従できない。申請者はこれまでに（比較的）早熟な黄色蛍光タンパク質（YFP）Venusを鋳型に、より早熟な変異体Achillesを開発したが、本研究では、発色団形成の律速となる酸化反応に着目した新たなスクリーニングを行い、さらに早熟な蛍光タンパク質を開発する。また、複数の遺伝子発現動態を同時可視化できるように、YFPと組み合わせて観察できる早熟なシアン色蛍光タンパク質（CFP）を創出する。
今年度は、大腸菌で（VenusやAchillesの開発時には行われていなかった）酸化プロセスの高速化に特化したスクリーニングを行った。Achillesの酸化速度を向上させる変異を複数発見できたため、都度酸化速度を確認しながらそれらの変異を組み合わせることで、酸化反応のより高速なYFPを得た。CFPについても開発を行い、結果Achillesや今年度得たAchilles変異体よりもさらに酸化反応の高速な変異体を見出すことができた。また、哺乳類細胞においても早熟なものとなっているかどうか成熟速度を評価する系を確立するため、顕微鏡下で培養細胞の蛍光観察を行いながら、パルス的にmRNAでの遺伝子導入を行う方法について検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
酸化プロセスに着目して行った大腸菌でのスクリーニングにより、有用な変異を複数発見し、これまでに開発したAchillesよりさらに酸化の速い黄色蛍光タンパク質（YFP）を作出できた。また、シアン色蛍光タンパク質（CFP）の開発についても、酸化速度においてAchilles（およびその変異体）よりもさらに高速な変異体を見出した。また、哺乳類細胞における早熟性の評価実験についても検討を終えることができたため、研究は順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに大腸菌でのスクリーニングで得た早熟変異体について、哺乳類細胞においても成熟速度が上がっているかどうかの検証を行う。今年度立ち上げた、顕微鏡下で培養細胞にパルス的にmRNAの遺伝子導入を行う系を用いて、蛍光発生のタイムコースを調べる。また、これらの早熟変異体を用いて、（従来ルシフェラーゼがより一般的に用いられている）レポーター遺伝子アッセイの系を構築する。プロモーター領域の下流に分解シグナルを融合した蛍光タンパク質を配し、転写活性時の蛍光発生によって、ルシフェラーゼに近い追従性で遺伝子発現を検出できるかどうか検証する。さらに、異なるプロモーター下でこれらの早熟CFP・YFPをレポーターに使用し、単一細胞内における遺伝子発現二種の同時可視化を試みたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は蛍光タンパク質の変異体試作に集中したが、想定よりも効率的に有用な変異を複数発見できたため、そのための消耗品の支出が少なくなった。哺乳類細胞での評価実験に要するmRNAに、分量が必要なことが今年度の検討でわかったため、次年度のmRNA合成酵素の購入に充当する。遺伝子工学試薬、培養試薬、培養ディッシュ、光学フィルターの購入を予定している。
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