| 研究課題/領域番号 |
20K05720
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
梅村 舞子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (00552259)
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| 研究分担者 |
渡邊 秀樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (90422089)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | DUF3328タンパク質 / 糸状菌 / ペプチド環化機構 / 環状ペプチド |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、Fungi界に広く分布するペプチド環化因子DUF3328の反応機構解明を目的としている。初年度である本年度は、大腸菌での大量発現・精製を目標として、DUF3328タンパク質を複数のベクターにクローニングし、複数の大腸菌ホスト株と培養誘導条件を検討した。対象とするDUF3328タンパク質はN末側に膜貫通領域を有する。そこでクローニングする際、天然の配列に加え、膜貫通領域をすべて取り除いたもの、異なる２か所でトリムしたものの計4種類を作製した。
まずpET16ベクターにクローニングしたものをBL21(DE3)、Origami系等4種類のホスト株に形質転換して10 mLスケールで培養し、ライセート全体でタンパク質発現を確認したところ、特に1つの株においてコンストラクトのサイズに応じた明確なスポットをWestern blotting (WB)で検出した。発現は天然型が最も弱く、膜貫通領域の途中でトリムした1つが最も高かった。そこで2 Lにスケールアップして同じ条件で培養しHisタグ精製を行ったところ、100/200/500 mMイミダゾールのいずれの溶出画分においても、WBによって非常に弱いシグナルしか検出されなかった。そこで不溶性成分をグアニジン塩酸塩によって可溶化してWB確認したところ、非常に強いシグナルが正しいサイズに検出されたことから、本タンパク質は大腸菌で発現はするが、変性状態となることが分かった。
また本環化因子の機能解明の鍵となる細胞内局在を観察するため、緑蛍光タンパク質（GFP）を融合させて高解像度共焦点顕微鏡にて観察した。オルガネラ局在マーカーとの共局在観察から、本環化因子があるオルガネラに局在することが分かった。この知見を基に、現在条件を絞って変性タンパク質のリフォールディングと精製を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
対象とするタンパク質の機能解析に必須な大量発現に加え、機能解析の重要な手掛かりとなる細胞内局在解析までを達成した。
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| 今後の研究の推進方策 |
対象とする系のペプチド環化に必要な他の2つのタンパク質の大量発現と安定状態での取得。基質とのin vitro反応と生成環状ペプチドの検出。糸状菌での環化因子発現・精製。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
おおむね順調に進捗しているが、雇用のタイミングによって人件費に余剰が生じた。
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