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2022 年度 実施状況報告書

発光ゴカイにおける新奇生物発光の分子基盤研究

研究課題

研究課題/領域番号 20K05741
研究機関国立研究開発法人産業技術総合研究所

研究代表者

安野 理恵  国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (30392674)

研究分担者 三谷 恭雄  国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (10358103)
研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2024-03-31
キーワード発光生物 / ルシフェラーゼ / ゴカイ
研究実績の概要

発光ゴカイは鮮やかな青緑色(510nm)の発光液を海中に分泌する発光生物である。1950年代には、ルシフェリン・ルシフェラーゼ分子による発光機構を有することが示されたが、それ以降詳細な解析は進められていなかった。本研究では、発光ゴカイの発光分子機構を解明することを目的として、in vitroにおける発光反応の生化学的解析、ルシフェラーゼの結晶構造解析を進める。これまでにゴカイルシフェラーゼの単離、同定に成功し、生体から抽出したルシフェリン溶液と動物培養細胞で発現させたルシフェラーゼタンパク質を用いてin vitro発光系を構築している。ルシフェリン分子については分子構造の報告はあるものの、人工合成系は未だ確立されていないため、生体試料からの粗抽出物を解析に使用する。構築した発光系において、発光反応のpH依存性や温度依存性、塩濃度依存性など、ゴカイ発光反応の生化学的特性の解析を進めている。一方で、得られる発光データに不安定さがみられることから、実験系の精査とルシフェラーゼタンパク質の粗精製を検討している。また、ゴカイルシフェラーゼタンパク質の特異抗体の作成および結晶構造解析に供試するために、ルシフェラーゼタンパク質の大量調整の検討を引き続き進めた。これまで、様々な発現プロトコールの改良や可溶化タグを付加し、組換えタンパク質の細胞外分泌を試みたが効果的な分泌率向上には至っていない。そこで、細胞内または膜タンパク質に蓄積または凝集していると思われる組換えタンパク質の可溶化の検討を進めた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

動物細胞発現のゴカイルシフェラーゼの大量調整を目指して、当初、細胞外分泌効率の上昇を目指したがポジティブな結果が得られなかった。一方、ウェスタン解析の結果から細胞内にはタンパク質が大量に蓄積していると想定されることから、変性剤と界面活性剤による可溶化を試みた。Ureaによる少量の可溶化は確認されたものの、その他の変性剤や界面活性剤による効果は得られていない。またタンパク解析のために作成したペプチド抗体2種を、少ルシフェラーゼを発現させた動物細胞粗抽出物に反応させたところ、特異的反応を示すと思われるバンドも確認された。一方で複数のフェイントバンドも多く確認され、ある程度精製したサンプルに対する定量性評価には活用できるが、組織化学的解析への転用は難しいと判断した。

今後の研究の推進方策

ルシフェラーゼを発現させた動物細胞の粗抽出液を用いた生化学的試験の結果は、データが不安定であることと、発光の経時変化に不可解な点があることから、His-tagで精製したルシフェラーゼでの再解析を予定している。また、結晶化に供試するタンパク質の調整が困難なことから、立体構造予測モデルを使った予想構造から活性中心付近のアミノ酸変異体を作成・解析し、発光ゴカイの発光分子機構の解明へ繋げる。

次年度使用額が生じた理由

当初の研究計画で想定した結果が得られず試験法の変更が生じたことに加え、本課題の遂行に必須となる生体試料サンプルの野外収集がコロナ下の状況で実施できなかったため、十分量の試料を確保できなかったことから、計画通りの進捗および予算使用とならなかった。
補助事業期間を延長し、2023年度中に研究計画の修正と未実施試験の実施を進める予定である。

  • 研究成果

    (1件)

すべて 2022

すべて 雑誌論文 (1件)

  • [雑誌論文] Gene Cloning and Functional Analysis of the Luciferase from Luminous Syllids of the Genus Odontosyllis2022

    • 著者名/発表者名
      Yasuno Rie、Mitani Yasuo、Ohmiya Yoshihiro
    • 雑誌名

      Bioluminescence: Methods and Protocols

      巻: 1 ページ: 3~15

    • DOI

      10.1007/978-1-0716-2453-1_1

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公開日: 2023-12-25  

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