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mRNAやノンコーディングRNAの機能を制御することが可能なsiRNAやアンチセンス核酸は、疾患に関連するタンパク質やRNAを阻害する核酸医薬として期待されている。申請者らはこれまでにRNA干渉の機構に着目し、非環状型の人工核酸Serinol Nucleic Acid (SNA)およびL-aTNAを用いて、活性の向上と副作用の抑制を実現するsiRNAや、人工塩基の導入よりmiRNA阻害活性の向上を達成したanti-miRNA oligonucleotide (AMO)の開発に成功してきた。本研究は、これまでに開発した非環状型人工核酸からなるsiRNAおよびAMOの活性発現機構を明らかにすることを目的としている。そのために、AMO-miRISCおよびsiRISC-mRNA複合体を検出する手法を開発し、細胞内可視化解析を実施することを目指している。
2022年度は、昨年度に引き続き近接状態にのみ反応が起こる系によるシグナル増幅を試みた。その結果、本反応に由来する蛍光シグナルは観察されるものの、擬陽性シグナルも多く観察される結果となった。条件を精査することで擬陽性シグナルを抑制することができた。一方、昨年度開発に成功した色素導入型miRNA/miRNA*およびAMOについて、設計を精査することでAMO-miRISC複合体をFRETを用いて観察する系を確立した。細胞内におけるFRETシグナルについてコントロールを用いたバックグラウンドシグナルとの差別化を行うことによって、細胞内でAMO-miRISC複合体が確かに形成されることを明らかとした。以上よりAMOの作用機序を明らかにすることに成功した。また、色素導入型miRNA/miRNA*開発の過程で、非環状型人工核酸からなるsiRNAも同様の機構で作動することが明らかとなった。
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