| 研究課題/領域番号 |
20K05778
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
石川 覚 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 農業環境研究部門, グループ長 (40354005)
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| 研究分担者 |
安部 匡 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 農業環境研究部門, 上級研究員 (70729201)
倉俣 正人 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 農業環境研究部門, 主任研究員 (80826991)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ヒ素 / イネ / ファイトケラチン / カドミウム / ゲノム編集 / 食の安全 |
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| 研究実績の概要 |
今年度はファイトケラチン合成酵素の一つについて、エラープローンPCRによる改変遺伝子を調製し、酵母細胞を用いたスクリーニングを行った。はじめに、エラープローンPCRに用いるMnイオンと酵母によるスクリーニングの亜ヒ酸処理濃度について条件検討を行った。OsPCS1活性制御領域である遺伝子の後半部分に着目し、エラープローンPCRによるランダム変異を導入するための条件検討を行った結果、1ng分のOsPCS1 cDNA鋳型に対して通常のPCR反応液に112.5uM MnCl2を添加し、40サイクルのPCR反応が一塩基の変異を効率よく導入できた。一方、酵母のヒ素耐性を指標にしたスクリーニング条件を亜ヒ酸濃度220uMと決定した。このPCR条件で増幅したDNA断片と酵母でのスクリーニング用シャトルベクターをモル比3：1で混合（Gap-Repair Cloningを利用）し、予めOsLsi1とAtABCC2をゲノムに挿入した酵母株にエレクトロポレーション法で導入した。改変OsPCS1遺伝子を導入した酵母細胞プールと対照の野生型OsPCS1を導入した酵母を亜ヒ酸を含む選択培地（プレート）に塗布し30℃、5日間の培養した結果、改変OsPCS1遺伝子のプレートからヒ素耐性クローンが出現した。一方、野生型OsPCS1を塗布したプレートにはコロニーは確認されなかった。この1次スクリーニング操作を2回行い、合計240のヒ素耐性クローンを得た。現在これらのクローンについて、2次スクリーニングとしてスモールスケールの液体培養系で単位時間当たりのPCs合成量評価を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
耐性クローンについて、ファイトケラチンの定量的な測定を年度内に行う予定だったが、やや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
獲得した耐性クローンに関しては、タンパク質生産用のベクター（pMAL-c5X）に組み込み、組換えタンパク質を大腸菌に作らせる。精製したタンパク質を還元型グルタチオンと亜ヒ酸またはカドミウム溶液で反応させた後、ファイトケラチン量をLC/MS/MSで測定する。選抜した耐性クローンのファイトケラチン合成量が高まっていれば、OsPCS1の機能欠損体に導入した組換えイネ個体を作製し、コメへのヒ素集積を調査する。その結果をもとに、ゲノム編集によるファイトケラチン合成酵素活性を強化したヒ素低集積イネの開発の可能性を探る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナの影響があり、業務の制限や非常勤職員の雇用が予定よりも短くなったりしたため。分析等に必要な消耗品や実験器具を購入する。
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