| 研究課題/領域番号 |
20K05783
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
有岡 学 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (20242159)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | オートファジー / 核 / ヒストンH2B-EGFP / Ypt7 / Atg15 / オートファゴソーム / 液胞 |
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| 研究実績の概要 |
核がオートファゴソームに取り囲まれた状態、および液胞に輸送された状態を可視化するため、オートファゴソーム膜と液胞膜の融合に関わる出芽酵母YPT7の麹菌オルソログAoypt7、および液胞内においてオートファゴソーム膜の分解に関わる出芽酵母ATG15のオルソログAoatg15をそれぞれ破壊した株を作製した。YPT7はRab様低分子量GTPaseを、ATG15は液胞リパーゼをコードする。両破壊株とも、麹菌オートファジー欠損株に見られる、気中菌糸および分生子の形成が著しく低下すると言う表現型を示した。これらを用いて実際にヌクレオファジーが欠損しているかを調べるため、ヒストンH2B-EGFP融合タンパク質を発現させ、その分解をプロセシングアッセイにより調べた。本アッセイでは、核が分解されなければヒストンH2B-EGFPのバンドが、核が分解されれば液胞プロテアーゼに耐性を持つEGFPのバンドが、それぞれウエスタンブロットで検出される。実験の結果、Aoypt7破壊株では予想通り窒素源および炭素源飢餓時のヒストンH2B-EGFPの分解は抑制された。一方、Aoatg15破壊株ではヒストンH2B-EGFPの分解はわずかしか低下しなかった。このことから、麹菌ではAoAtg15以外の液胞リパーゼがオートファゴソーム膜の分解に関わることが示唆された。現在、両遺伝子破壊株におけるヒストンH2B-EGFP蛍光の観察を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヌクレオファジーにおいて核がどのような段階や形態変化を伴って分解されるかはわかっていない。本研究で得たAoypt7破壊株やAoatg15破壊株を用いることで核分解の中間状態を捉えることができれば、核がどのような過程を経て分解されるか理解が進展することが期待される。また、ヌクレオファジーにおいて核の認識に関わる受容体はこれまで見つかっていない。本研究で前年度までに見出したNprAはその有力な候補であり、新奇性の高い重要な発見と考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き野生株およびAoypt7破壊株、Aoatg15破壊株におけるヒストンH2B-EGFP蛍光の観察を行う。また、NprAの機能について、その局在変化の機構を中心に解析を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は前々年度までに行った大掛かりなスクリーニングを行う必要がなく、効率よく実験を進めることができた。来年度以降はNprA結合タンパク質のスクリーニングなど再び探索研究を展開する予定のため予算的な余裕が必要である。
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