研究課題
モデルシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803は主染色体の他に長さ40 kbp以上の巨大プラスミドを4つ有しているが、巨大プラスミドの維持機構は不明である。申請者はSynechocystisにおいて染色体にコードされたRep様タンパク質（CyRepX）を見出し、CyRepX欠損株のゲノムにおいて巨大プラスミドの一つpSYSXと染色体の融合を検出した。本申請研究ではシアノバクテリアの巨大プラスミドの維持機構の解明と、これを利用した大規模ベクターシステムの構築を目指す。ゲノム構造解析法（MP-seq、PFGE-SB）を確立しCyRepX遺伝子欠損株のゲノム構造を解析した結果、染色体-pSYSX間の融合のホットスポットを発見した。しかしPFGE-SB解析より、CyRepX欠損株ではpSYSX全長が染色体に融合している訳ではなく縮小したpSYSXが依然としてプラスミドとして存在していることが示唆された。また巨大プラスミドpSYSAにコードされるCyRepXホモログ（CyRepA）についても遺伝子破壊株を取得し同様の解析を実施した。CyRepX欠損株とは異なり、CyRepA欠損株は全てのpSYSAが染色体に取り込まれていることがわかった。さらにSynechocystisの染色体およびプラスミドに含まれるRep機能を持つタンパク質を遺伝学的に探索することを目的として、DNAライブラリーを作成した。制限酵素によって消化したSynechocystisのゲノムを大腸菌ColEオリジンとcat遺伝子と共に大腸菌に形質転換して約20000クローンから成るランダムDNAライブラリーを得た。
2: おおむね順調に進展している
巨大プラスミド構造の解析手法を確立でき、計画通りSynechocystisのRepX、RepAの破壊株のゲノム構造が特異であることを示すことができたため。SynechocystisのDNAライブラリーの作成も順調であり、今後の研究の進展が期待できる。
CyRepX破壊株における「縮小したpSYSX構造」についてさらに解析を進める。またCyRepAは巨大プラスミドpSYSAの維持に関わること、CyRepA破壊株における染色体とpSYSAのインテグレーションは1 kbp程度の挿入配列（IS）を介していることが示された。今後はCyRepA欠損株の他のクローンを用いてインテグレーション領域の解析を行なう。CyRepXとCyRepAの二重欠損株も取得することができたため、これらのゲノム構造も併せて解析する。現在、DNAライブラリーのSynechocystisへの形質転換を行なっており、Synechocystis細胞内において自律複製活性を有する領域を有するクローンを選抜中である。クローンが得られ次第、候補領域の絞り込みを行う予定である。
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