| 研究課題/領域番号 |
20K05797
|
|---|
| 研究機関 | 福山大学 |
|---|
研究代表者 |
広岡 和丈 福山大学, 生命工学部, 教授 (20389068)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | 枯草菌 / タンパク質発現 / ラムノース / フラボノイド / 細菌フェロモン |
|---|
| 研究実績の概要 |
今年度は、ラムノースまたはフラボノイドで誘導される発現系の構築を行なった。
ラムノース誘導系に関して、枯草菌ラムノース異化オペロン (rhaEWRBMA) は２つの転写因子 (RhaRとCcpA) で制御され、ラムノースで誘導され、グルコースで抑制される。この制御領域を元に、コアプロモーター上流域 (UP) とSD配列を高効率型に替えたハイブリッド発現系を構築し、egfpと連結して枯草菌染色体に単コピーで組み込み、得られたレポーター株をこれまで作製した各レポーター株とともに各条件で培養し、発現量を蛍光測定で評価した。その結果、ラムノース特異的誘導能を維持しつつ、元のプロモーターよりも誘導条件での発現量の向上が認められた。次に、このハイブリッド発現系の下流にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を連結し、これをRhaRの直接の誘導物質が蓄積するように代謝酵素遺伝子を欠失させた枯草菌株の染色体に組み込み、さらにT7プロモーターとegfpとの連結をもつプラスミドを導入し、マルチコピー型発現系を作製した。このレポーター株について、予備的な培養実験を行なったところ、炭素源をグルコースからラムノースに替えることで発現が誘導されたが、ラムノースを加えずともグルコース欠乏でEGFPが過剰発現する結果となった。
フラボノイド誘導系に関して、２つの転写因子 (LmrAとQdoR) で制御され、フラボノイドで誘導されるqdoI-yxaHオペロンの制御領域を元に、上記と同様にUPとSD配列を高効率型に置換したハイブリッド発現系を構築して発現量を評価したが、この発現系では蛍光は検出されなかった。そこで、コアプロモーターを保存配列に置換した改良版発現系を構築して発現量を調べたところ、フラボノイドによる発現誘導は認められたが、非誘導条件でもEGFPがある程度発現しており、当該転写因子による抑制の低下が考えられた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
枯草菌のラムノース異化オペロンの制御領域のUPとSD配列を高効率型に置換することで、ラムノース添加時の発現量を有意に向上させることができた。しかしながら、このハイブリッド発現系での絶対的な発現量は単コピーでは不十分だったので、これを用いてT7 RNAポリメラーゼを発現誘導させ、標的遺伝子をプラスミド上のT7プロモーター制御下に置くことでマルチコピー発現系を作製し、誘導条件下での発現量の増大を試みた。現段階では予備実験のみであるが、予想外に、この発現系ではラムノース添加で特異的に誘導されるのではなく、グルコースが消費されると著しく発現量が増大する結果となった。この理由として、T7 RNAポリメラーゼを厳密に制御して発現誘導を行うには、今回用いたハイブリッド発現系の発現強度が強過ぎであり、ラムノース非存在下でRhaRが抑制に作用する条件でもグルコース欠乏でCcpAによるカタボライト抑制が解除されて十分量のT7 RNAポリメラーゼが生じたと考えられた。今後、T7 RNAポリメラーゼの発現制御を担う領域を改良していくが、T7 RNAポリメラーゼとT7プロモーターを組み合わせたマルチコピー型発現系を今年度で確立できた。また、ラムノース誘導型発現系では、ラムノース代謝中間体 (ラムヌロース-1-リン酸) がRhaRの直接の誘導物質であるが、代謝が進むとこれが減少して誘導が低下する。これを防ぐために下流の代謝に関わる酵素 (RhaEW) の遺伝子をインフレームで欠失させた。これにより、少量のラムノース添加で誘導が持続すると考えられる。
改良版のフラボノイド誘導型ハイブリッド発現系では、非誘導条件での発現抑制が十分ではなかったが、上記のマルチコピー型発現系に、発現量は少ないが厳密な制御が可能なフラボノイド誘導型発現系を導入すれば、発現量の向上と厳密な制御を両立できると思われる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今年度の研究で作製したラムノースでの誘導を意図したマルチコピー型発現系では、T7 RNAポリメラーゼの発現制御に用いたハイブリッド発現構築の発現強度が強過ぎたので、これを元のrhaEWプロモーターに置換することで、ラムノースとグルコースでより厳密な制御が可能なマルチコピー型発現系の作製を目指す。また、プラスミドに組み込んだT7プロモーターにはlacオペレーターも含まれているので、プラスミド上にLacI遺伝子を導入することで非誘導条件で目的遺伝子の発現を極力抑え、枯草菌細胞の増殖に影響を及ぼすようなタンパク質の生産も可能とする発現系の構築も試みる。
上記のマルチコピー型発現系において、T7 RNAポリメラーゼの発現制御を担う領域をフラボノイド誘導型発現構築に置換し、フラボノイド誘導されるマルチコピー型発現系の作製を試みる。
得られた各発現系を有する枯草菌レポーター株を種々の条件で培養・蛍光測定を行い、発現誘導の最適条件を検討する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬と器具の購入が予定よりも少なかった。また、出張費の使用がなかった。翌年度分と合わせて物品費・論文投稿費等に使用する。
|
