| 研究課題/領域番号 |
20K05800
|
|---|
| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪産業技術研究所 |
|---|
研究代表者 |
駒 大輔 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 森之宮センター, 主任研究員 (80443547)
|
|---|
| 研究分担者 |
古屋 俊樹 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 講師 (20367064)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | ニトロゲナーゼ / 窒素固定 / 大腸菌 / 合成生物学 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本年度では、大腸菌の染色体に導入するためのニトロゲナーゼ遺伝子クラスターを選別し、それらを人工合成し、さらに大腸菌の染色体に導入することを目指した。まず、ニトロゲナーゼ遺伝子クラスターのクローニングにおいては、適当なクラスターを選別する必要があった。そこで、クローニングするニトロゲナーゼ遺伝子クラスターの候補を、さまざまな微生物種のゲノム情報や文献の中から調査した。その中から、大腸菌で活性を示すことが見込まれる遺伝子として、大腸菌の近縁種であるKlebsiella oxytoca由来の物を選択した。
候補のニトロゲナーゼ遺伝子クラスターは巨大であり、14種類の遺伝子から構成されていた。それをそのまま合成したりクローニングすることは困難であった。また、この大きさのDNAを大腸菌の染色体DNAに挿入することも困難であり、また、DNAのハンドリングの困難さも予想された。そこで、これらのクラスターを9つに分割し、それぞれを人工的に合成した。人工合成した遺伝子をさらにoverlap extension PCR等によってつなぎ合わせ、最終的に5つの遺伝子クラスター（nifJVW、nifUS、nifHDK、nifENB、nifFMY）を得た。次に、それらの遺伝子クラスターを、大腸菌の染色体に導入するためのベクターにサブクローニングした。
今後、これらのクローニングされた各遺伝子クラスターを大腸菌の染色体に順次導入し、完全なニトロゲナーゼ遺伝子クラスターを大腸菌内に再現する予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コロナ禍やそれに付随した緊急事態宣言等の影響により、カルチャーコレクション等からの菌株の入手や、業者からの実験機器の入手に通常よりも時間がかかった。また、遺伝子合成も通常よりも大幅に時間がかかった。実験材料を揃え終わったのが年度の後半になってしまったため、予定よりも進行が遅れた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
クローニングしたニトロゲナーゼ遺伝子を大腸菌の染色体に順次導入し、ニトロゲナーゼ遺伝子クラスターを大腸菌内に再構築する。これを東京理科大学の共同研究者に送付し、ニトロゲナーゼ活性は発現しているかどうか評価してもらう。
その次に、リボヘモグロビンなどの酸素防御タンパク質の遺伝子をクローニングし、ニトロゲナーゼ発現株に導入する。その株も同様に共同研究者に評価してもらう。加えて、窒素雰囲気下で、菌株の生育が見られるかどうか評価する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
概ね予定通りに予算を執行できたが、学会の中止等によって、予算が少し未執行となった。次年度以降、DNA合成関係に係る費用の一部に使用する予定である。
|
