| 研究課題/領域番号 |
20K05800
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪産業技術研究所 |
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研究代表者 |
駒 大輔 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 森之宮センター, 主任研究員 (80443547)
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| 研究分担者 |
古屋 俊樹 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 准教授 (20367064)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 窒素固定 / ニトロゲナーゼ / 大腸菌 / アセチレンアッセイ / 人工オペロン / Klevsiella |
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| 研究実績の概要 |
Klevsiella oxytoca由来の人工合成した遺伝子をPCRを用いてつなぎ合わせ、nifUS、nifENB、nifFMY、nifJVW、nifHDKの5つの人工オペロンを作製した。それらを、Red相同組換え法を用いて、大腸菌の染色体の各位置に挿入した。次に、P1ファージを用いて、各大腸菌株をP1ライセート化し、P1トランスダクションにより、K12株に順次遺伝子を移した。菌株はカナマイシンを含むLB寒天培地で選抜した。また、選抜したコロニーから、FLP/FRT部位特異的組換え法により、カナマイシン遺伝子を除去した。これにより、再度、P1トランスダクションで、カナマイシン耐性で菌株が選抜できるようになった。これらの一連の操作（P1トランスダクションとFLP/FRT部位相同的組換え法）を繰り返すことで、染色体の5か所の位置に各人工オペロンを挿入することができた。PCRを用いて、14種類の遺伝子が染色体上に挿入されていることを確認した。人工オペロンの各遺伝子の発現をT7プロモーターで制御しているため、T7RNAポリメラーゼ遺伝子（lacプロモーター制御）を染色体DNAに導入した。この遺伝子も正しく挿入されていることをPCRで確認した。
次に、リアルタイムPCRを用いて、各遺伝子が発現（転写）されているかどうかの確認を行った。比較のために、大腸菌MG1655株を用いた。遺伝子発現誘導剤であるIPTGのある場合とない場合とを試験した。その結果、MG1655株では遺伝子の発現が見られなかったが、人工オペロンを導入した株では各遺伝子の発現が見られた。不思議なことに、IPTGを添加していない条件でも、遺伝子の発現が見られた。
最後に、これらの菌株のニトロゲナーゼ活性の確認（アセチレンアッセイ）と、窒素固定による生育試験を行った。しかしながら、両試験で想定された結果は得られなかった。
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