| 研究課題/領域番号 |
20K05802
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
日高 將文 東北大学, 農学研究科, 助教 (00584848)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | タンパク質工学 / 転写因子 / タンパク質発現・精製 |
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| 研究実績の概要 |
微生物は生育環境中の栄養源、ストレス源などの濃度変化を感知し、増殖や生存のため遺伝子・タンパク質の発現量を増減させる。そのメカニズムを追求していくと、どのタンパク質が関与しているのか？については分かってくる。では、それらのタンパク質はどのように物質濃度を感知しているのか？その感知した情報をどのように発現レベルにつなげているか？
発現制御の分子メカニズムは、いわばブラックボックスとなっているものが多く、微生物の応用を妨げる一因ともなっている。このブラックボックスの解明には、タンパク質分子レベルの研究が不可欠である。本研究は、これまでの微生物学を含む農学研究であまり用いられることがなかった放射光の測定技術を積極的に導入し、分子レベルの微生物の発現制御メカニズム解明にアプローチする。そのための研究ターゲットとして、麹菌の4種の転写因子、AmyR、MalR、CreA、FlbCを選び、機能解析、構造解析を目指す。
2021年度は、MalR、FlbCについて、機能解析、構造解析を目指して大腸菌による発現系の構築を試みた。大腸菌で発現したMalRは封入態を形成し、可溶な状態で獲得ができなかったことから、変性剤の添加による可溶化、ならびに除去によるリフォールディング条件を検討したところ、添加剤存在下で可溶化することが分かった。リフォールディングの条件を検討することで、大腸菌1リットル培養当たり数ミリグラムのタンパク質獲得に成功した。結晶化スクリーニングによって獲得した結晶を、高エネルギー加速器研究機構でX線回折測定を実施したが、回折は得られなかった。現在、結晶化条件の探索を継続している。
FlbCはGST融合タンパク質として獲得した。DNAフラグメントとの相互作用解析から、DNA結合能を有した状態で精製に成功した。現在結晶化条件の探索を試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
転写因子の研究では、タンパク質が不安定化、不溶化することで、精製タンパク質が獲得できないことが多く、タンパク質の獲得に困難を伴うことは想定されていた。その中で、MalRとFlbCの精製に成功したことは、研究2年目の成果としては順調であると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
大腸菌による発現系が構築できたMalRについては、DNA結合能を評価することで機能の発現を確認するまた、X線結晶構造解析を目指して、結晶化を試みる。FlbCについてはX線結晶構造解析を目指して結晶化を試みる。
AmyR、CreAの転写因子については、引き続き大腸菌を用いた発現系の構築に取り組みつつ、並行して酵母発現系の構築も検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究では、進捗の状況によってはSPring8（兵庫県）や高エネルギー加速器研究所（茨城県）の放射光を利用した実験に進めるため、あらかじめ治具、測定派遣のための旅費を計上していたが、その段階まで研究が進まなかったため。
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