産業微生物の転写因子研究の分子レベルアプローチ

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K05802
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 日高 將文 東北大学, 農学研究科, 助教 (00584848)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: タンパク質工学 / 転写因子 / タンパク質発現・精製

研究実績の概要

微生物は生育環境中の栄養源、ストレス源などの濃度変化を感知し、増殖や生存のため遺伝子・タンパク質の発現量を増減させる。そのメカニズムを追求していくと、どのタンパク質が関与しているのか？については分かってくる。では、それらのタンパク質はどのように物質濃度を感知しているのか？その感知した情報をどのように発現レベルにつなげているか？
発現制御の分子メカニズムは、いわばブラックボックスとなっているものが多く、微生物の応用を妨げる一因ともなっている。このブラックボックスの解明には、タンパク質分子レベルの研究が不可欠である。本研究は、これまでの微生物学を含む農学研究であまり用いられることがなかった放射光の測定技術を積極的に導入し、分子レベルの微生物の発現制御メカニズム解明にアプローチする。そのための研究ターゲットとして、麹菌の4種の転写因子、AmyR、MalR、CreA、FlbCを選び、機能解析、構造解析を目指す。
2022年度はFlbCについて、機能解析、構造解析を目指して大腸菌による発現系の構築を試みた。大腸菌で発現したFlbCは1リットル培養当たり1ミリグラムに満たず、結晶構造解析に供するためには不十分であった。発現条件、精製条件を検討し、特に培地条件を精密化することで、大腸菌1リットル培養当たり5ミリグラムのタンパク質獲得に成功した。精製FlbCはゲルシフト電気泳動解析により、DNAに結合する機能を有していることが確認された。結晶化スクリーニングによって、ポリエチレングリコールを沈殿剤とした結晶を獲得することができており、今後、放射光を利用したX線回折データ測定に供する予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

転写因子の研究では、タンパク質が不安定化・不溶化することで精製タンパク質が獲得できないことが多く、タンパク質の獲得に困難を伴うことは想定されていた。その中で機能を有するFlbCの獲得に成功したことは、成果としては順調であると考えている。一方で、コロナウイルス感染拡大の影響により、放射光測定実験の機会が制限されたため、本来予定していたX線回折測定実験に進むことができなかったことは、当初の予定より遅れてしまったと考えざるを得ない。

今後の研究の推進方策

大腸菌による発現・精製系が構築できたFlbCについては、X線結晶構造解析を目指して結晶化ならびにX線回折実験に進む。
AmyR、CreAの転写因子については、引き続き大腸菌を用いた発現系の構築に取り組みつつ、並行して酵母発現系の構築も検討する。

次年度使用額が生じた理由

コロナウイルス感染拡大、および電力費高騰による放射光運転期間短縮の影響により、当初予定していた放射光測定を実施することができなかったため。
2023年度は放射光施設を利用したX線結晶構造解析を実施するため、旅費と諸経費を計上する。