| 研究課題/領域番号 |
20K05803
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
古園 さおり 東京大学, 生物生産工学研究センター, 准教授 (90321760)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ピルビン酸デヒドロゲナーゼ / 2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ / Corynebacterium |
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| 研究実績の概要 |
Corynebacterium glutamicumのピルビン酸デヒドロゲナーゼ (PDH) と 2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ (ODH)は、ハイブリッド酵素複合体として存在するという他生物種には見られない極めてユニークな特徴を有する。 2020年度は、大腸菌組換えタンパク質を用いたin vitro再構成を行い、ハイブリッド複合体におけるサブユニット組成及び2つの活性との相関について検討した。E2-E3部分複合体にE1pまたはE1oを添加するとそれぞれPDHおよびODH活性を検出できた。再構成サンプルをゲル濾過クロマトグラフィーで分析した結果、E2-E3およびE1oを含む画分が観察され、ODH複合体を捉えることができた。標準タンパク質分子量との比較からE2-E3部分複合体およびODH複合体の分子量を算出し、E1o: E2: E3のサブユニット組成比は4:6:8と推定された。一方PDH複合体はゲル濾過クロマトグラフィーで観察されず、E2-E3に対するE1pの結合はE1oに比べて弱いことが示唆された。再構成したPDHにE1oを添加するとPDH活性の阻害が観察された。再構成したODHに対するE1p添加でも同様の阻害が観察されたが、前者と比べて阻害効果は弱く、E2-E3に対するE1pの結合がE1oに比べて弱いことが支持された。再構成したODHにOdhIを添加するとODH活性の阻害が観察され、ゲル濾過クロマトグラフィーではODH複合体とOdhIは同じ画分への溶出が観察された。従って、OdhIはODH複合体からE1o を解離させるのではなく、複合体へ結合することによりODH活性を阻害することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画の(a) in vitro再構成複合体を用いたサブユニット組成の同定と活性との相関関係、および(b) OdhIハイブリッド複合体への作用機序について明らかにでき、論文として報告した。順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は研究計画に従い、E2 サブユニットの PSBDドメインに見出されているアセチル化部位の機能解析を進める。PSBDドメインはE1及びE3サブユニットが結合する部位であり、その修飾や変異は複合体のサブユニット組成に影響を与え、PDHとODH活性のバランスに影響をもたらすことが予想される。PSBD ドメインの非アセチル化模倣変異で本菌のグルタミン酸生産が上昇する結果が得られており、グルタミン酸生産上昇につながるメカニズムを明らかにすることを目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウィルスの影響で成果発表のための出張の機会がなくなったため、旅費の支出が抑えられた。次年度ではアセチル化部位変異解析およびタンパク質構造解析に向けた費用に充てる。
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