| 研究課題/領域番号 |
20K05804
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
吉田 彩子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (90633686)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 代謝調節 / アシルCoA / 短鎖脂肪酸 / Thermus thermophilus / 機能未知酵素ホモログ |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質翻訳後修飾と制御タンパク質との相互作用により活性調節されることがこれまでに明らかにされているCoA transferase (CoAT)について、制御機構の詳細を明らかにするため、CoATと制御タンパク質の複合体の結晶構造解析に引き続き取り組んだ。様々な工夫を行ったが、これまでに複合体の結晶構造決定には至っていない。
CoAT活性は制御タンパク質存在下において、NAD+/NADH比に応じて調節されることから、この制御タンパク質が細胞内のNAD+/NADH比のセンサーとしての働きを持つことが示唆される。複合体の構造決定が難航しているため、CoATと制御タンパク質間の相互作用様式について、NAD(H)存在下において等温滴定カロリメトリーを用いて調べた。結果、NAD(H)存在下においてCoATと制御タンパク質とのアフィニティが異なることが明らかとなった。
T. thermophilusに4つ存在するアシルCoA合成酵素（ACS）ホモログについては、これまでにDNA結合モチーフを持ちACS活性を持たないACSホモログ（ACS2）が、他のacsホモログの培地条件依存的な発現調節に関与することを見出している。
ACS2のDNA結合能を調べるため、ACS2やACS2の推定DNA結合ドメインの組換えタンパク質発現系の構築を進めているが成功していない。代わりに、ACS2の推定DNA結合残基の変異体を作製した。acs2破壊株の変異体acs2遺伝子での相補実験より、DNA結合残基が、ACS2による培地条件依存的な他のacsホモログの発現調節に重要であり、ACS2が転写因子として機能することが示唆された。
また、大腸菌でacsを含む酢酸資化に関わる遺伝子の発現調節に関わることが知られているIclRのホモログ遺伝子についても遺伝子破壊株等の解析を進めており、ACS2による制御との関連を調べている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の目標であったCoATと制御タンパク質の複合体の結晶構造決定には至っていないが、CoATと制御タンパク質間の相互作用が制御タンパク質の結合リガンドであるNAD+やNADHの存在下で変化することを見出した。制御タンパク質の結晶構造解析からNAD+結合による構造変化が見いだされているため、この変化がCoATとの相互作用に影響を与え、CoAT活性が調節されると結論づけられた。
ACSに関しては、DNA結合モチーフをもち、酵素活性を示さないACS2が、転写因子として働くことを示すことができた。また、acsを含む酢酸資化に関わる遺伝子の発現調節に関わるIclRのホモログ遺伝子についても解析を進め、T. thermophilusにおいてもIclRホモログが酢酸資化に関与することを見出した。
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| 今後の研究の推進方策 |
CoATと制御タンパク質の複合体の構造解析については結晶構造解析ではなく、可能であればクライオ電顕といった別の方法で引き続き構造決定を目指していきたいと考えている。また、ホモログとの配列比較により予想される両者の結合に重要そうなアミノ酸の置換体を作製し、相互作用解析やドッキングシミュレーションにより分子機構解明への手がかりを得たいと考えている。
ACSについては、acsホモログの発現調節へのACS2やIclRが関与するのかなど、RNAseq等の網羅的解析を利用して明らかにすることで、（酢酸）代謝におけるこれらの役割について解明を目指す。またACS2が細胞内の代謝産物と考えれらるリガンド濃度を感知してacsホモログの転写誘導を行っていると考えらえる。これまでにACS2のACSドメインに反応中間体が結合しうることを結晶構造により明らかとなっており、この化合物がリガンドとして機能する可能性を考慮しつつ、ACS2のリガンドとして機能する物質を探索・同定したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウィルスの影響で成果発表のために参加した学会がオンラインとなり出張の機会がなくなったため、旅費の支出が抑えられたことや、当初の予定していたメタボローム解析やトランスクリプトーム解析などの実験が先延ばしになっているため。
現在ACSの転写調節に複数の転写因子が関わる可能性を考えており、これらの遺伝子破壊株におけるRNAseqなどの解析に使用したい。また、ACS2の組換えタンパク質の調製が難航しているため、コドン最適化した合成遺伝子の購入や無細胞タンパク質合成系キットの購入費用に充てる予定である。
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