| 研究課題/領域番号 |
20K05808
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
竹中 慎治 神戸大学, 農学研究科, 教授 (40314512)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Aspergillus / 好乾性糸状菌 / 鰹節 / 脂質分解酵素 |
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| 研究実績の概要 |
鰹節カビ優占種5種（A. amstelodami、A. chevalieri、A. pseudoglaucus、A. ruber、A. sydowii）由来粗酵素液について、脂質分解活性およびイオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターンには相違が見られた。一方、粗酵素液とcod liver oilとの反応によって遊離した脂肪酸の構成比は、優占種5種の間で類似していた。つまり、鰹節カビ由来の脂質分解酵素群は、トリアシルグリセロール中の飽和または一価不飽和脂肪酸（C16:0, C16:1, C18:0, C18:1）エステルを好んで加水分解しており、EPA（C20:5）やDHA（C22:6）といった多価不飽和脂肪酸エステルはあまり加水分解されなかった。A. chevalieri由来粗酵素液をDEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィーに供すると、荷電の異なるリパーゼ/エステラーゼ画分が少なくとも5つ見られた。これら5つの画分をさらに精製し、LCMSMS-Mascot解析からcutinase、carboxyl esteraseを含む5種類リパーゼ/エステラーゼ類を同定することができた。同定したこれらの酵素の中で、cutinase、phospholipaseB以外は麹菌由来類縁酵素とは類似性が見られず、既報の脂質分解酵素とは異なる分解酵素群が発酵に関わっていることがわかった。また、リパーゼ/エステラーゼ類以外にも、ペプチダーゼ等の加水分解酵素だけでなく、抗酸化酵素であるcatalase BやCu/Zn SODも同定することができた。そこで、優占種5種由来粗酵素液およびDEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィー後の画分について抗酸化酵素活性を調べると、確かに活性が見られた。食品の発酵や保存時において、脂質の酸化は悪臭の発生や変色をもたらし、品質を低下させる。約6か月かかる長期の発酵熟成工程において、鰹肉中の脂質の分解は同定した脂質分解酵素群によって徐々に進行するといえるが、酸素から生成する活性酸素や過酸化水素が発端となる脂質過酸化を抑制する機構のひとつとして抗酸化酵素群も同工程にかかわると結論した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2020年度の計画通り、鰹肉の脂質分解に関わる酵素群のタンパク質同定を完了し、それらの役割を考察について原著論文としてInternational Journal of Food and Microbiology誌に投稿した。現在、miner revisedの段階であり、2021年度前半には完了予定である。
また、異種発現系は、計画していた8つの脂質分解酵素中4つについて構築済みであり、予定通り進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
A. chevalieri由来脂質分解酵素（cLip 1からcLip 5）およびA. pseudoglaucus由来同酵素（pLip 1から3）までについて組換え酵素の発現系を構築し、①脂肪酸エステルの分解特性、②低水分活性下における分解活性、③同遺伝子の発現様式からいずれの酵素が鰹節かび付け発酵において重要な役割を果たすか明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請時の計画では、脂質分解酵素の異種発現系を構築すると同時にその最適化を図る計画であったが、新型コロナウィルス感染拡大の関係で、共同で行う予定の学生が大学に来ることができなかった。そこで、申請者（代表者）ができる異種発現の構築に注力したため、使用額の差が生じた。
2021年度は、研究室学生も従来通り研究室にて実験が可能なため、当初の予定通り、異種発現株の培養条件の検討を行うことで2020年度に購入予定であった物品を購入するつもりである。また、得られた成果を所属学会で発表する予定である。
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