凝縮核様体依存的末端結合によるDNA修復機構の解明

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K05813
• 研究機関: 東洋大学
• 研究代表者: 鳴海 一成 東洋大学, 生命科学部, 教授 (90343920)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: DNA修復タンパク質 / 放射線抵抗性細菌 / ゲノム二本鎖切断修復

研究実績の概要

凝縮核様体依存的末端結合によるDNA修復機構の解明の一環として、D. radioduransのddrA遺伝子及びpprA遺伝子の二重欠失株、ddrAP遺伝子及びpprA遺伝子の二重欠失株を作製した。具体的には、pprAプロモーター上流750 bp、pprA遺伝子下流領域750 bpを、4種類の異なる制限酵素切断部位タグ付きプライマーでそれぞれPCR増幅後、制限酵素処理とライゲーションで、スペクチノマイシン耐性マーカー供給プラスミドpKatAAD (2,241 bp)に連結したDNA断片を用いて、ddrA遺伝子欠失株を形質転換し、ddrA pprA遺伝子二重欠失株を作製した。また、D. radiodurans ddrAP遺伝子についても同様にして、pprA遺伝子をスペクチノマイシン耐性マーカーとすげ替えた形のddrAP pprA遺伝子二重欠失株を作製した。作製した2種類の遺伝子二重欠失株のゲノム構成を確認したところ、両欠失株とも、多倍体ゲノムを持つ1細胞中、複数コピー存在するpprA遺伝子の一部が欠失した形のHemi体であることが判明した。現在、スペクチノマイシン存在下で繰り返し増殖させることで、pprA遺伝子がすべてのゲノムコピーから排除されたHomo体の取得を試みている。パルスフィールドゲル電気泳動によるゲノム2本鎖切断修復過程の解析については、これまでに確立した供試細胞濃度、アガロースゲルプラグの調製方法、プロテイナーゼK処理及び制限酵素NotI処理の条件を用いて、細胞菌体のブレオマイシン処理条件の検討を行い、ブレオマイシンによるD. radioduransのゲノムに生じた二本鎖切断を初めて可視化観察することに成功し、さらに、ブレオマイシン処理後の液体培地での菌体培養によってブレオマイシンで誘発された二本鎖切断の修復反応が亢進していく過程を初めて可視化することができた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

gyrA gyrB遺伝子との多重遺伝子欠失株がまだ作製できていない。二重遺伝子欠失が細胞にとって致死的であることも考えられるが、過去の実験で示されているナリジクス酸やノボビオシンに対する感受性の程度を勘案すると、多重遺伝子欠失株の取得は可能であると考えられる。

今後の研究の推進方策

複数コピーの遺伝子の一部のみが欠失した形のHemi体の培養を続けてHomo体が取得できない場合であっても、Hemi体の変異原に対する反応を野生株と比較することで、欠失遺伝子の機能がある程度推定可能となると考えられるため、Hemi体を用いた遺伝子破壊効果の解析を進める予定である。

次年度使用額が生じた理由

消耗品の期間限定キャンペーン等により生じた300円未満の差額である。2021年度に執行予定のオリゴヌクレオチドプライマーの購入費の一部として補充する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Construction of luciferase reporter strains for functional analysis of DNA damage response regulator PprI in Deinococcus radiodurans (2021)
  • 著者名/発表者名: Satoh Katsuya, Sanzen Toshihiko, Oono Yutaka, Narumi Issay
  • 雑誌名: QST Takasaki Annual Report 2019 巻: QST-M-29 ページ: 96
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Functional analysis of radiation-inducible protein DdrA and its paralog DdrAP in Deinococcus radiodurans (2021)
  • 著者名/発表者名: Futami Yusuke, Satoh Katsuya, Tomita Naoki, Sanzen Toshihiko, Shimosaka Taichi, Oono Yutaka, Narumi Issay
  • 雑誌名: QST Takasaki Annual Report 2019 巻: QST-M-29 ページ: 97
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Draft Genome Sequence of Calcium-Dependent Novosphingobium sp. Strain TCA1, Isolated from a Hot Spring Containing a High Concentration of Calcium Ions (2020)
  • 著者名/発表者名: Fujinami Shun、Satoh Katsuya、Narumi Issay、Ito Masahiro
  • 雑誌名: Microbiology Resource Announcements 巻: 9 ページ: －
  • DOI: 10.1128/MRA.00145-20
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] DNA Damage and Survival Time Course of Deinococcal Cell Pellets During 3 Years of Exposure to Outer Space (2020)
  • 著者名/発表者名: Kawaguchi Yuko、Shibuya Mio、Kinoshita Iori、Yatabe Jun、Narumi Issay、Shibata Hiromi、Hayashi Risako、Fujiwara Daisuke、Murano Yuka、Hashimoto Hirofumi、Imai Eiichi、Kodaira Satoshi、Uchihori Yukio、Nakagawa Kazumichi、Mita Hajime、Yokobori Shin-ichi、Yamagishi Akihiko
  • 雑誌名: Frontiers in Microbiology 巻: 11 ページ: －
  • DOI: 10.3389/fmicb.2020.02050
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Complete Genome Sequence of the Cesium-Accumulating Bacterium Rhodococcus qingshengii CS98, Isolated from Soil in Japan (2020)
  • 著者名/発表者名: Satoh Katsuya、Ozawa Shogo、Hayashi Hidenori、Tomioka Noriko、Narumi Issay、Oono Yutaka
  • 雑誌名: Microbiology Resource Announcements 巻: 9 ページ: －
  • DOI: 10.1128/MRA.01188-20
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 放射線抵抗性細菌のDNA修復機構の解明と応用展開 (2021)
  • 著者名/発表者名: 鳴海一成
  • 学会等名: 未来へのバイオ技術勉強会「南極、深海から宇宙まで～新奇・極限微生物のめぐる戦略」
  • 招待講演
• [学会発表] たんぽぽ計画：全宇宙曝露試料の帰還と微生物試料解析の現状 (2021)
  • 著者名/発表者名: 山岸明彦, 橋本博文, 矢野創, 横堀伸一, 河口優子, 小林憲正, 三田肇, 藪田ひかる, 東出真澄, 田端誠, 河合秀幸, 今井栄一, 富田-横谷香織, 木村駿太, 鳴海一成, 矢田部純, 藤原大祐
  • 学会等名: 第35回宇宙環境利用シンポジウム
• [学会発表] 地球生物の宇宙生存可能性検証のための短期宇宙曝露実証実験システムの構築 (2021)
  • 著者名/発表者名: 横堀伸一, 鳴海一成, 時下進一, 志賀靖弘, 杉本学, 今井栄一, 三田肇, 橋本博文
  • 学会等名: 第35回宇宙環境利用シンポジウム
• [学会発表] Radiation Resistant Microbes (2020)
  • 著者名/発表者名: Narumi Issay
  • 学会等名: Russian-Japanese Bilateral Conference on Microbe in the High Radiation Environments 2020
  • 国際学会
• [学会発表] Exposure experiment of deinococcal species in Tanpopo Mission at Exposure Facility of Japanese Experiment Module of International Space Station (2020)
  • 著者名/発表者名: Yokobori Shin-ichi, Kawaguchi Yuko, Yatabe Jun, Fujiwara Daisuke, Hayashi Risako, Kinoshita Iori, Murano Yuka, Shibuya Mio, Narumi Issay, Hashimoto Hirofumi, Yamagishi Akihiko
  • 学会等名: EANA2020 Virtual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] 放射線抵抗性細菌 Deinococcus grandis pprI発現大腸菌の特性解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 勝又康介, 鳴海一成
  • 学会等名: 第21回極限環境生物学会年会
• [学会発表] 宇宙空間で3年間曝露したデイノコッカス細胞塊の生存曲線とDNA損傷 (2020)
  • 著者名/発表者名: 河口優子, 鳴海一成, 柴田裕実, 橋本博文, 今井栄一, 小平聡, 内堀幸夫, 中川和道, 三田肇, 横堀伸一, 山岸明彦
  • 学会等名: 第21回極限環境生物学会年会
• [学会発表] 国際宇宙ステーションにおけるたんぽぽミッションで宇宙曝露された放射線耐性菌Deinococcus radiodurans R1のrpoB遺伝子変異分析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 横堀伸一, 藤原大祐, 河口優子, 富樫油香, 木下伊織, 矢田部純, 鳴海一成, 橋本博文, 山岸明彦
  • 学会等名: 第21回極限環境生物学会年会
• [学会発表] 福島第一原発近隣の環境サンプルに由来する微生物のメタ16S解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 藁科友朗, 佐藤朝子, Shagimardanova Elena, 丸山茂徳, 森宙史, 鳴海一成, Oleg Gusev, 齋藤元文, 眞田幸尚, 佐々木祥人, Shaykhutdinov Nurislam, 島田梢, 黒川顕, 戎崎俊一, 西村昭彦, 駒義和, 金井昭夫
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Rubrobacter sp. AA3-22の放射線と紫外線に対する耐性 (2020)
  • 著者名/発表者名: 泉洸輝, 佐藤勝也, 大野豊, 宮崎健太郎, 鳴海一成
  • 学会等名: QST高崎サイエンスフェスタ2020
• [備考] 極限環境微生物の研究から「生命科学の真髄」を学ぶ
  • URL: http://www.toyo.ac.jp/nyushi/column/video-lecture/20150603_01.html
• [備考] 東洋大学 生命科学部 放射線微生物学研究室
  • URL: http://www2.toyo.ac.jp/~narumi/
• [備考] 東洋大学 研究者情報データベース
  • URL: http://ris.toyo.ac.jp/profile/ja.a2cc3f430e87b3e77d1b37996e9736fa.html
• [備考] 東洋大学入試情報サイト 生命科学科 放射線微生物学研究室
  • URL: http://www.toyo.ac.jp/nyushi/undergraduate/lsc/dlsc/laboratory/narumi.html