| 研究課題/領域番号 |
20K05832
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
梶川 昌孝 近畿大学, 生物理工学部, 講師 (40594437)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 植物分子生物学 / 栄養欠乏 / オートファジー / 藻類生理学 / 変異体解析 / タンパク質リン酸化酵素 / 細胞内シグナル伝達 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ハイスループットな変異株スクリーニングによる順遺伝学解析系が確立されたモデル緑藻クラミドモナスを活用し、植物界で先駆けて従来型のオートファジー因子とは異なる新奇な細胞生存を制御する分子機構の包括的な解明を目指している。本年は、表現型の緩やかなオートファジー変異体（atg9）への更なる変異導入により選抜されたN・S・Pのいずれの栄養欠乏条件においても生存性が親株よりも早期に低下する変異体1C7および21B1変異株の解析を進めた。昨年度、これらの変異体ではそれぞれ異なるタンパク質リン酸化酵素遺伝子（1C7遺伝子、21B1遺伝子と名付けた）に挿入変異を持つことを明らかにしている。それぞれの変異体と野生型との交配により、ATG9への変異とそれぞれのタンパク質リン酸化酵素遺伝子の変異を分離した。1C7遺伝子あるいは21B1遺伝子にのみ変異をもつ子孫系統の生存率に関する表現型は、元の1C7および21B1変異株と同等であった。このことから、1C7および21B1変異株における生存率低下の表現型にはATG9の変異は寄与せず、もっぱら1C7遺伝子あるいは21B1遺伝子への変異によるものであることが示唆された。それぞれの単独変異体に野生型の1C7遺伝子および21B1遺伝子を導入すると変異表現型は野生型と同程度まで回復した。21B1遺伝子に蛍光タンパク質Venus遺伝子およびFLAGタグを連結したプラスミドを構築し、21B1遺伝子の単独変異体に導入したところ、表現型の回復とともにFLAG抗体を用いたウェスタン解析において予想サイズにシグナルが見られた。このシグナルの強度は栄養欠乏条件の切り替えの前後で変化しなかったことから、21B1タンパク質の発現レベルは栄養欠乏による制御を受けていないことが示唆された。今後、細胞内のVenus由来蛍光パターンの観察により細胞内局在の推定を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
栄養欠乏条件での早期細胞死変異株1C7および21B1の単離とその機能解析により、栄養欠乏下での細胞生存性の維持に関与する新規なタンパク質リン酸化酵素遺伝子を２個（1C7遺伝子、21B1遺伝子）見出した。それぞれの子孫系統での遺伝子型と表現型の相関性、1C7遺伝子、21B1遺伝子それぞれの単独変異体への相補実験により、1C7遺伝子、21B1遺伝子がそれぞれの変異表現型の原因遺伝子であるとの明確な結果を得ることができた。1C7遺伝子、21B1遺伝子の単独変異体を背景とした蛍光タンパク質との融合タンパク質発現による相補系統を用いた細胞内局在解析、組換えタンパク質を用いたリン酸化活性の評価、相互作用因子の探索などの準備を既に進めている。これらの解析により、藻類の栄養欠乏ストレスに応答した細胞内シグナル経路の新たな分子機構が明らかになることが期待される。以上のことから進捗状況について上記の通り評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1C7遺伝子、21B1遺伝子の機能解明のための更なる解析として、1. Venus融合型タンパク質発現系統の蛍光パターンの観察による1C7、21B1タンパク質の細胞内局在部位の推定、2. 大腸菌発現系を用いた組換えタンパク質の単離精製とそれを用いたタンパク質リン酸化活性のin vitroでの評価、3. リン酸化活性に重要なアミノ酸残基を変異させた各遺伝子の単独変異体への導入による変異相補性の検証、3. FLAGタグ融合タンパク質発現系統を用いた免疫沈降またはFLAGタグ抗体ビーズによる相互作用因子の探索を同時並行的に推進する。これにより得られた機能解析データを元に論文投稿を行う予定である。既に、21B1単独変異体を背景とした21B1-Venus-FLAG発現系統および21B1-FLAG発現系統を構築し、いずれも変異表現型の相補を確認している。また大腸菌発現用にコドン最適化した21B1遺伝子を入手済みである。リン酸化活性に必須と推定されるリジン残基をメチオニン置換した変異型21B1遺伝子の発現プラスミドを構築し、21B1系統に導入している。以上のように次年度の研究のための準備状況は整っており、既に一部の研究を進行している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ感染拡大により参加予定していた学会がオンライン開催になっため、出張旅費が当初計画よりも小額となったため。次年度には物品費として変異体の解析費用に充当することを予定している。
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