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2021 年度 実施状況報告書

リソソーム膜の損傷応答におけるEF-ハンド蛋白質ALG-2の生理機能解明

研究課題

研究課題/領域番号 20K05837
研究機関名古屋大学

研究代表者

牧 正敏  名古屋大学, 生命農学研究科, 特任教授 (40183610)

研究分担者 高原 照直  名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (90708059)
研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2023-03-31
キーワードカルシウム / リソソーム / ESCRT / 近接依存性標識法 / ALIX / ALG-2 / 膜損傷 / LC-MS/MS解析
研究実績の概要

(I)ALG-2はホモ二量体あるいはそのパラログであるPeflinとヘテロ二量体を形成しカルシウムイオンセンサーとして機能している。そこで、PeflinのGFP融合蛋白質(GFP-Peflin)をHeLa細胞に発現させ、リソソーム損傷誘発剤L-Leucyl-L-Leucine methyl ester(LLOMe)を処理後、GFP-Peflinの局在を観察した。その結果、ALG-2と同様にGFP-PeflinがLLOMe処理細胞においてリソソームに動員されていた。次に、Peflinノックアウト細胞とALG-2とPeflinのダブルノックアウト細胞を作出し、LLOMe処理後の細胞応答を検討したところ、Peflinノックアウト細胞ではLLOMe処理後のオートファジーが低下していることを見出した。また、コントロール細胞、ALG-2ノックアウト細胞、ALG-2とPeflinのダブルノックアウト細胞と比較して、Peflinノックアウト細胞はLLOMe処理後に細胞死を起こす細胞が増加している傾向があった。
(II) 前年度にダイズ由来アスコルビン酸の変異酵素APEX2を用いた近接依存性標識法による解析により、LLOMe処理依存的にALG-2に近接する蛋白質として同定された3種の蛋白質について、LLOMe処理後の局在を解析した。その結果、2種は損傷リソソームに同定されたが、1種はLLOMe処理の前後で顕著な局在変化は見られなかった。損傷リソソームへの局在が観察された蛋白質1種について、領域欠損変異体を細胞に発現させ、損傷リソソームへの局在を担う領域を同定した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ALG-2のパラログでありALG-2とヘテロ二量体を形成するPeflinが損傷リソソームに動員される現象を見出し、ALG-2、Peflinそれぞれのノックアウト細胞、およびダブルノックアウト細胞を作出し、それらの損傷リソソーム応答の解析をすすめられている。、また、LLOMe処理依存的にALG-2に近接する蛋白質の中から、損傷リソソームに動員される蛋白質を同定しており、それらの機能解析をすすめられる状況にある。以上のように、本年度の研究は計画に沿って順調に進展した。

今後の研究の推進方策

ALG-2およびPeflinのノックアウト細胞とALG-2とPeflinのダブルノックアウト細胞において、リソソーム損傷後の細胞応答に違いが見られつつある。このことは、ALG-2ホモ二量体とALG-2とPeflinのヘテロ二量体の存在比がこれらのカルシウム結合蛋白質を介する応答に違いをもたらしていると考えられる。今後は、ノックアウト細胞にALG-2およびPeflinの野生型と変異体を発現させその表現型を解析するとともに、ALG-2とPeflinが制御する細胞応答についてカルシウム依存的に作用する標的蛋白質を特定し、分子メカニズムの解明をすすめる。また、ALG-2に近接して損傷リソソームで機能する蛋白質について、その発現抑制やノックダウンがリソソーム損傷を引き金とする細胞応答に与える影響を解析する予定である。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2022 2021

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (6件)

  • [雑誌論文] Amino Acid-Mediated Intracellular Ca2+ Rise Modulates mTORC1 by Regulating the TSC2-Rheb Axis through Ca2+/Calmodulin.2021

    • 著者名/発表者名
      Amemiya Y, Nakamura N, Ikeda N, Sugiyama R, Ishii C, Maki M, Shibata H, Takahara T
    • 雑誌名

      Int J Mol Sci

      巻: 22 ページ: -

    • DOI

      10.3390/ijms22136897

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] ALS原因遺伝子産物TDP-43の定量的解析を目的としたモデル培養細胞の開発2022

    • 著者名/発表者名
      舟橋里帆、高原照直、牧正敏、柴田秀樹
    • 学会等名
      日本農芸化学会2022年度(令和4年度)大会
  • [学会発表] 動物細胞の成長制御を司るmTORC1経路のCa2+シグナルによる調節機構の解析2021

    • 著者名/発表者名
      雨宮優奈、池田奈央、牧正敏、柴田秀樹、高原照直
    • 学会等名
      第85回日本生化学会中部支部例会・シンポジウム
  • [学会発表] mTORシグナルとカルシウムシグナルのクロストーク2021

    • 著者名/発表者名
      雨宮優奈、杉山理紗、高原照直
    • 学会等名
      第11回TOR研究会
  • [学会発表] 動物細胞のアミノ酸応答におけるカルシウムの作用機序の解明2021

    • 著者名/発表者名
      雨宮優奈、池田奈央、柴田秀樹、牧正敏、高原照直
    • 学会等名
      日本農芸化学会中部支部第190回例会
  • [学会発表] 細胞成長制御を司る mTORC1 経路の新規制御因子の探索と同定2021

    • 著者名/発表者名
      小林海咲、石井千愛、牧正敏、柴田秀樹、高原照直
    • 学会等名
      日本農芸化学会中部支部第190回例会
  • [学会発表] Ca2+シグナルを介したTSC2-Rheb-mTORC1経路の制御2021

    • 著者名/発表者名
      高原照直
    • 学会等名
      第2回シロリムス新作用研究会

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公開日: 2022-12-28  

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