2020 年度実施状況報告書

藻類バイオマス開発のための嫌気的代謝スイッチング制御メカニズムの解明

研究課題

研究課題/領域番号	20K05844
研究機関	大阪府立大学
研究代表者	太田大策大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (10305659)
研究分担者	三芳秀人京都大学, 農学研究科, 教授 (20190829)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	藻類バイオマス / 脂質合成 / 還元的TCA回路 / 電子伝達
研究実績の概要	微細藻類 Euglena gracilis は，好気的環境において，余剰の光合成産物をβ-1,3-グルカン（パラミロン）に変換して貯蔵する。パラミロン蓄積量は細胞乾燥重当たり 50% 以上に達する。嫌気環境では，パラミロンを炭素骨格の供給源とした脂肪酸合成が誘導され，ワックスエステル（WE, 細胞乾燥重当たり30% 以上）に変換される。この嫌気的WE合成には，ミトコンドリアのロドキノン（RQ）を介した電子伝達経路と還元的TCA回路を経由する代謝経路が関与する。これまでに，425 種類の芳香族化合物から構成される独自のケミカルライブラリーをスクリーニングし，キノン骨格を持つ複数の化合物（OATN003,1,8-dihydroxy-10H-anthracen-9-one; OATQ008, 1,4-diaminoanthracene-9,10-dione; ONAQ008, 2-methylnaphthalene-1,4-dioneなど）がユーグレナの著しいWE 蓄積増強作用を持つことを発見した。最も高いWE蓄積増強能を有する化合物の添加では，通常の3 倍量の WE が蓄積した。これらのキノン類がWE合成能を増強するメカニズムを解明することを目的として研究を進めた。WE合成には，RQを経由するミトコンドリア電子伝達とフマル酸還元酵素の関与が必須であるため，これらのキノン類がミトコンドリアの機能に関わると考え，暗所でのミトコンドリア呼吸活性への影響を調べた。呼吸活性はONAQ008添加で2.5倍に上昇したが，OATN003添加では1.1倍の上昇にとどまった。またOATQ008添加では顕著な影響は認められなかった。この結果は，これらの化合物が異なる作用機作を持つ可能性を示している。今後，単離ミトコンドリアにおいて，キノン類の作用点解明をすすめる。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由化合物ライブラリースクリーニングでキノン骨格を持つ化合物が嫌気的WE合成を促進することを発見した。本研究の目的は，これらの化合物の作用機作を解明することにあるが，WE合成促進をもたらす化合物の至適濃度，蓄積する脂質の性質は未調査であり，WE合成の炭素源となるパラミロンの消長についても不明である。まずこれらの化合物処理がどのような影響を与えるかを精査することに焦点をあてた。まず，嫌気的WE合成が促進される際の，貯蔵糖質パラミロンの消費量を調べた。通常（キノン類無添加）の嫌気的WE合成量は，暗所24時間の培養で細胞あたり7pgであった。この時，パラミロンが約50％残存した（細胞あたり37 ± 2 pg）。キノン類，OATN003，OATQ008，ONAQ008，を濃度100 microM で添加した時，WE蓄積量はそれぞれ2.3倍，2.8倍，2.4倍に増加した。この時のパラミロン残存量はそれぞれ，18％，8％，23％となっていた。すなわち，これらのキノン化合物添加によるWE合成の促進は，パラミロン消費の促進を伴うこと，すなわち貯蔵糖質を利用から脂質合成までの一連の代謝活性が促進されることを示している。また，この条件下で，蓄積するWEの組成をGC-MSによって分析したところ，炭素鎖長29-32の脂肪酸を含むWEが増加していた。これらの結果から，キノン化合物の存在下，細胞質での貯蔵糖質の分解促進によって，ミトコンドリアへのリンゴ酸あるいはピルビン酸の供給量が増加し，アセチルCoAおよびプロピオニルCoAを前駆体とする脂肪酸合成の促進が起こったと推察される。しかしながら，これらのWE合成促進の作用点は，単離ミトコンドリアでの活性確認が必須である。
今後の研究の推進方策	キノン骨格を有する活性化合物がE. gracilisのミトコンドリア電子伝達活性に及ぼす影響を，好気条件と嫌気条件で比較する。好気条件で培養したE. gracilis の生細胞を用いた実験では，活性化合物がミトコンドリア呼吸活性を促進することがわかった。そこで，細胞レベルからオルガネラレベルでの実験を行うことで，活性化合物の作用点の絞り込みを行う。実験では，WE合成は嫌気環境において進行するため，これらの活性化合物が，好気的な代謝と嫌気的な代謝のそれぞれで別の作用を有するのか，あるいは共通の作用点を持つのかを重点的に調べる。まず，E. gracilisを嫌気条件下で培養し，嫌気的代謝経路が誘導されたミトコンドリアを単離するための実験条件を整える。同時に，好気的に培養したE. gracilisからもミトコンドリアを単離する。このようにして単離したミトコンドリアは異なる代謝活性を有するはずである。まず，ミトコンドリア膜電位測定用蛍光プローブによって，活性化合物添加の影響を調査する。さらに，呼吸基質，ピルビン酸，リンゴ酸などを添加し，活性化化合物の存在下で培養し，どのようなWE合成の中間代謝物が蓄積するかをLC-MSとGC-MSを用いて分析する。また，クリックケミストリーによる作用点解明のための活性化合物の誘導体化を開始する。